[发明专利]检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒，该方法包括：(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与核酸上的部分序列互补；形成互补后，核酸在沿已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入待检测的可逆性阻断dNTP，使已知序列延伸一个碱基；然后加入带荧光的dNTP，使至少部分序列继续延伸一个碱基；(c)采集反应后产物的荧光信号，并根据荧光信号的强度推算出待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。本发明的方法能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度，并且精确度更高。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒。

背景技术

近年来，在基因测序技术领域，与其它测序方法相比，边合成边测序(sequencingby synthesis,SBS)的测序方法以其通量高、价格低而获得青睐。在这一测序方法中，可逆性阻断dNTP是测序的中心也是测序成本最主要和最影响测序质量的一环。在加入每个可逆性阻断dNTP后，3’阻断基团的存在阻止其它核苷酸加入合成的链中。在去除阻断基团后，恢复天然游离的3’羟基基团用于加入下一个核苷酸。但是如果由于合成或者存储等步骤导致非常少量的3′阻断基团脱落，就会增加测序的定相(Phasing)和预定相(Prephasing)，所谓“定相(Phasing)”是指SBS中的现象，该现象由3’阻断基团和荧光基团的不完全除去引起，不能通过聚合酶在给定的测序循环中将DNA链的一部分完全并入到合成链中。“预定相(Prephasing)”是由在不存在有效的3’阻断基团的情况下，核苷酸并入所引起的，并且该并入事件预先进行了1个循环。这使测序过程移相发生的更严重、更快，从而降低读长，增加错误率，降低测序质量。这在不同的测序平台上都有体现。

可逆性阻断dNTP，在核苷酸糖基的3'位连一个叠氮基团(结构式是-CH₂N₃)或硫硫键、烯丙基作为3’阻断基团。这个3’阻断基团在链延伸时起到阻止聚合的作用。其中，叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂(例如，二巯基丙醇)，会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基。叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，是导致测序时预定相的主要原因。因此，可逆性阻断dNTP的纯度对二代测序的质量有极大影响。

可逆性阻断dNTP目前使用HPLC(高效液相色谱法)进行提纯，纯度一般能达到99.0％以上。尽管经过HPLC提纯的可逆性阻断dNTP，纯度达到99.0％以上，在测序过程中，由于各种因素比如叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，从而导致预定相，影响测序质量，因此需要设计一种质控可逆性阻断dNTP的方法。

发明内容

本发明提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒，能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，包括：

(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与上述核酸上的部分序列互补；形成互补后，上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；

(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入上述待检测的可逆性阻断dNTP，使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入上述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基；

(c)采集反应后的产物的荧光信号，并根据上述荧光信号的强度推算出上述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。

进一步地，上述两个特异的待测碱基是不同的碱基。