[发明专利]一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法有效
| 申请号： | 201611208506.7 | 申请日： | 2016-12-23 |
| 公开（公告）号： | CN106755110B | 公开（公告）日： | 2020-09-01 |
| 发明（设计）人： | 吴锦艳;张志东;尚佑军;田宏;陈妍;王光祥;刘湘涛;王耀杰;张吉利 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 甘肃省知识产权事务中心 62100 | 代理人： | 鲜林 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 增强 pprv 复制 敏感 细胞 克隆 vero slam 制备 方法 | ||
1.一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于包括合成山羊信号淋巴细胞激活分子slam/V引物序列，通过构建山羊slam/V慢病毒表达载体，获得slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子，以获得的slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子感染Vero靶标细胞，筛选稳定表达slam/V的Vero阳性细胞亚克隆，验证阳性细胞亚克隆Vero/Slam/V表达的Slam/V的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果；
所述slam/V引物带有与载体匹配的B位点同源臂，其序列为：
SEQ ID NO.1: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC
TTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,
SEQ ID NO.2: GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGG
CATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG；
所述Slam/V表达载体的构建，包括Slam/V与pDONRTM221供体载体进行 B、P 位点重组，获得入门载体pDONR/Slam/V，pDONR/Slam/V 与pLenti 6.2/V5- DEST™ Gateway®Vector 表达载体进行 L、R 位点重组获得表达克隆pDEST/ Slam/V；
所述筛选稳定表达slam/V的Vero阳性细胞亚克隆，是采用杀稻瘟菌素blasticidin进行抗性筛选，获得稳定表达Slam/V的Vero阳性细胞亚克隆；所述Vero细胞对杀稻瘟菌素blasticidin的耐受浓度为3.5ug/ml。
2.根据权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述获得Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子，是将pDEST/Slam/V质粒与包装混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同转染人胚肾细胞株293-FT，收获细胞上清，获得具有感染性的Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子。
3.如权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的验证，采用靶标基因扩增方法、间接免疫荧光方法、western-blot免疫印迹检测方法及致细胞病变效应分别验证slam/V基因组整合、转录，slam/V蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达slam/V的阳性细胞亚克隆上的增殖效果。
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