[发明专利]一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法

说明书

本发明提供一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法，包括如下步骤：采集收割当天的转Bt基因作物秸秆和土壤样品作为阳性对照，之后每隔10天采集一次秸秆样品和土壤样品作为试验处理；抽提秸秆样品和土壤中的总蛋白；透析法除去总蛋白抽提液中的盐离子；冷冻浓缩总蛋白至干粉状；添加总蛋白干粉至二化螟(Chilo suppressalis)人工饲料；不添加总蛋白干粉的人工饲料作为空白对照；在超净工作台中分装人工饲料入二化螟饲养瓶；每瓶接入孵化24h之内的二化螟幼虫15头，瓶口用扎有孔的保鲜膜和黑布封口；接虫后放入28℃、光照16D:8L的人工气候箱中培养；10天后取出养虫瓶，观察鉴别二化螟的死亡和发育情况，计算外源蛋白在环境中的相对持留量和活性衰减动态。

技术领域

本发明涉及转Bt基因作物环境安全评价技术领域，具体涉及一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法。

背景技术

转基因作物在批准商业种植之前和之后需要经过严格的环境安全评价，以确定风险等级和风险防范措施。转基因抗虫作物与传统作物主要不同在于前者体内持续表达外源基因的蛋白，这些外源蛋白在作物生长过程中和收获之后随根系分泌和秸秆样品进入环境，因此，追踪转基因作物外源蛋白的去向和活性衰减过程是转基因作物环境安全评价的重要部分。目前，酶联免疫吸附技术(ELISA)是检测土壤和植株样品中Bt外源蛋白残留量的首选方法，然而，ELISA技术特别灵敏，已经部分降解、失去生物活性的Bt外源蛋白也可以引起免疫反应，另外，因为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在土壤中普遍存在，即使在从未种植过Bt作物的田间土壤中也可以用ELISA方法检测到阳性反应，因此，ELISA技术可能高估Bt外源蛋白进入环境的量和在环境中的持留时间。本专利采用水稻二化螟为靶标生物，样品建立了一套Bt外源蛋白在环境中持留期和相对持留量的生物测定方法，可为更真实地评价Bt抗虫作物的环境安全性提供参考。

发明内容

针对ELISA技术在检测环境Bt外源蛋白中过于灵敏的缺陷，本发明的目的是提供一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法。二化螟是Bt蛋白的靶标生物，利用二化螟的人工饲料的成熟培养技术，将环境中残留的外源蛋白提取出来，添加到人工饲料中，测定外源Bt蛋白对二化螟初孵幼虫的毒力反应，达到评价环境中外源蛋白的持留期和持留量的目的。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法，包括如下步骤：

1)在种植Bt作物的田块采集秸秆样品和土壤样品；

2)对秸秆样品和土壤样品进行预处理；

3)提取秸秆样品和土壤样品中的总蛋白；

4)对总蛋白提取液进行透析纯化和冷冻干燥浓缩；

5)将浓缩后的总蛋白加入二化螟人工饲料；

6)分装二化螟人工饲料入饲养瓶；

7)将孵化24小时之内二化螟幼虫接入饲养瓶；

8)培养10天后检查二化螟的死亡与生长发育情况，计算外源蛋白在环境中的相对持留量和活性衰减动态。

根据以上方案，所述样品的采集方法为：转Bt基因作物收割当日在种植转Bt基因作物的田间采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为阳性对照，之后每隔10天在种植转Bt基因作物的田块采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为试验处理，收割当日的秸秆样品采集量大于5kg、10cm深的根围土集采量大于10kg，之后每次秸秆样品采集量大于500g、10cm深的根围土大于1000g，采集好的样品用大号自封袋装好，贴上标签，-40℃以下保存。