[发明专利]人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用。本发明的人源分子伴侣样蛋白Archease由179个氨基酸组成，分子量为20.7kDa；在大肠杆菌表达菌株Bl21(DE3)plus中可溶性表达且表达量较高。动态光散射表明Archease在结合RNA剪切连接酶辅因子GTP后粒径变大，与其功能发挥紧密相关。Archease的晶体结构分辨率为1.96Å。该结构由7个β折叠和4个α螺旋组成。Archease在辅助同一操纵子蛋白如RNA剪切连接酶、甲基转移酶发挥作用方面起到了重要的催化调节作用，是内质网应激蛋白XBP1 mRNA的成熟加工过程中所必需。解析Archease的三维晶体结构有助于阐明其作用机理，从而更好的发挥并拓宽其作用范围。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源分子伴侣样蛋白Archease及其表达纯化、晶体结构、动态光散射结果及其在辅助多种蛋白发挥作用方面的重要作用。

背景技术

Archease从古生物到人都高度保守，具体作用底物仍未被发现，人源Archease能够催化RNA剪切连接酶RTCB发挥作用，在果蝇中缺失Archease会阻碍视神经轴突的再生，嗜热古菌Archease能催化甲基转移酶发挥作用。在Archease存在的情况下可以明显加速RNA剪切连接酶及甲基转移酶发挥作用。根据已有的报道Archease对与其同一操纵子的蛋白起到了催化剂的作用，而与Archease处于同一操纵子的许多蛋白对于生化反应的进行具有重要的调控作用，内质网应激蛋白XBP1mRNA的成熟加工过程中Archease的辅助作用是必需的。Archease辅助蛋白均在免疫过程中发挥了重要作用。因此通过结构生物学方法获得Archease的晶体结构及利用动态光散射结果表明在结合辅因子后粒径的变化对于找到其作用底物，阐明其作用机理从而进一步拓宽其应用具有重要的指导作用。

发明内容

本发明的目的在于提出人源分子伴侣样蛋白Archease及其表达纯化、晶体结构、动态光散射结果及其在辅助多种蛋白发挥作用方面的应用。

本发明涉及对人源Archease进行密码子优化，以获得在大肠杆菌中以可溶性形式表达的重组蛋白；对重组蛋白进行纯化、结晶；获得人源Archease第20位到第179位氨基酸的三维晶体结构，及其应用。

本发明首先对人源Archease进行了密码子优化，得到密码子优化的人源Archease。具体将其全长基因克隆在pet28b+表达载体上，选用Nco1及Xho1酶切位点，为避免移码突变的产生，在起始密码子ATG后的添加以鸟嘌呤开头的丙氨酸，在本发明描述过程中其他氨基酸顺序依次顺延。同时保留载体上C-端的6XHis，用于后续纯化工作。

本发明涉及的人源Archease,含179个氨基酸，分子量为20.7kDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明优先选择使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其它细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优先选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其它标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。

本发明还提供表达和纯化人源Archease的方法，该方法包括：构建了人源Archease重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的重组蛋白Archease，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法(优选Ni亲和层析(分离原理为：低咪唑浓度缓冲液进行上样，高咪唑浓度缓冲液进行洗脱))，分离出目的蛋白，经凝胶过滤层析，得到高纯度的重组蛋白Archease。