[发明专利]来自食神鞘氨醇杆菌的肝素酶及其制备和应用

权利要求书

1.从Sphingo. spiritivorum细菌中得到新型肝素酶SShepI、SShepII，所述肝素酶经SDS-PAGE检测分子量分别约为71 kD、92 kD。

2.Sphingo. spiritivorum细菌中得到新型肝素酶SShepI、SShepII的方法，包括以下步骤：

(1) 将Sphingo. spiritivorum菌株制备成斜面或其它保存用种子；

(2) 将步骤(1)所述的菌株接种到种子培养基中，培养1~2天后，接入二级液体种子培养基中，培养1~2天后，再接入发酵培养基中，培养1~5天，收集细胞，离心；

(3) 将步骤(2)得到的沉淀悬浮在Tris-HCl缓冲液中，低温下破碎细胞，离心取上清，冰浴经硫酸铵沉淀后收集饱和度60%~80%的沉淀组分，将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析；

(4) 酶的粗分离：

将硫酸铵沉淀后的酶用SP层析柱纯化，在上样液和洗脱液中均分布有肝素酶活性的组分，分别收集；

(5) SShepI酶的纯化：

将上述与SP柱结合后被洗脱下来的有酶活性组分上样于CS柱，平衡后以0.1~1 M NaCl(溶于Tris-HCl缓冲液) 线性梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，8~10 ℃过夜透析；之后，将活性组分上样于SP柱，平衡后用0.105 M NaCl (溶于Tris-HCl缓冲液) 等度洗脱，收集有酶活的洗脱液；最后，将收集到的活性组分稀释后上样于CS柱，平衡后以0.1~1 M NaCl(溶于Tris-HCl缓冲液) 线性梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，即为肝素酶 SShepI；

(6) SShepII酶的纯化：

将前述SP柱上样流出液有酶活性的组分上样于Q柱，平衡后在同样缓冲液中用0~0.5 MNaCl梯度洗脱，收集有酶活性组分， 8~10 ℃过夜透析；将活性组分上样于CS柱，平衡后在同样缓冲液中用0.1~0.6 M NaCl梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶SShepII；

步骤(3)、(4)、(5)、(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl₂的Tris-HCl, pH 6.5-8.0,Tris-HCl优选的浓度为5-50 mM，最优选的浓度为20 mM；CaCl₂的含量优选1~50 mM，最优选10 mM；优选的pH范围为7.0~7.5，更优选7.0；

步骤(4)中所述的SP柱为SP-Sepharose Fast Flow，也可为其它强阳离子交换柱；

步骤(5)、(6)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate，也可为结合了肝素的CNBr-activated Sepharose CL-4B等可与肝素酶结合的亲和柱；

步骤(6)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow，也可为Q-Sepharose Big Beads、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose High Performance等强阴离子交换柱。

3.新型肝素酶SShepI、SShepII用于低分子肝素、超低分子肝素的生产制备。

4.新型肝素酶SShepI、SShepII用于肝素、低分子肝素、超低分子肝素的质量检测。