[发明专利]一种重组肠激酶的纯化方法

说明书

本发明提供一种重组肠激酶的纯化方法，所述方法采用芳香族疏水层析填料，通过洗脱液洗脱得到纯品；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B等体积混合形成，所述洗脱缓冲液A的配比为：20mmol Tris‑HCl、1mol/L NH₄Cl，pH为7.0‑8.0；所述洗脱缓冲液B的配比为20mmolTris‑HCl，pH为7.0‑8.0。本发明提供的重组肠激酶的纯化方法，仅需要一次纯化洗脱就可以得到电泳纯的肠激酶样品，避免了多次反复纯化所带来的产品流失以及成本损耗，在得到纯品的同时收率得到大幅度的提高。

技术领域

本发明涉及药物合成及化工领域，特别是涉及一种重组肠激酶的纯化方法。

背景技术

肠激酶(enterokinase)存在于高等动物的十二指肠粘膜中，是使胰蛋白酶原水解而成为活性胰蛋白酶的肽链内切（endo-peptidase）。此反应要比由胰蛋白酶自身触媒引起的活性化快数十倍，且其切割位点具有高度专一性，特异性识别DDDDK序列，关于肠激酶的应用研究、重组研究已经逐步被业内人士所重视。

目前，在肠激酶的纯化领域一般都是采用阴离子层析纯化、阳离子层析纯化、反相层析纯化交替进行的方式进行，为了获得纯度较高的肠激酶需要进行多次纯化，费时、费力，并且最终产率低，不符合工业化大量生产的需求。

肠激酶的纯化过程中，对于具有活性的粗酶液纯化，是整个制备过程的最后一个步骤，也是非常关键的步骤，如何获得高纯度的肠激酶同时收率提高对于重组肠激酶的制备来说至关重要，目前的纯化方法普遍存在的纯化难度高、纯化步骤复杂、纯化收率低等问题；此外，现有技术的纯化方法中，还存在洗脱液中含有影响肠激酶活性的乙醇、且存在分辨率低，成本高等缺点。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种重组肠激酶的纯化方法，仅需要一次纯化洗脱就可以得到电泳纯的肠激酶样品，避免了多次反复纯化所带来的产品流失以及成本损耗，在得到纯品的同时收率得到大幅度的提高。

本发明所采用的技术方案为：一种重组肠激酶的纯化方法，所述方法采用芳香族疏水层析填料，通过洗脱液洗脱得到纯品；所述洗脱液由洗脱缓冲液A与洗脱缓冲液B等体积混合形成，所述洗脱缓冲液A的配比为：20mmol Tris-HCl、1mol/L NH₄Cl，pH为7.0-8.0；所述洗脱缓冲液B的配比为20mmolTris-HCl，pH为7.0-8.0。

优选的，所述芳香族疏水层析填料中的疏水配基为苯基，如Phenyl 6FF疏水层析填料；疏水配基为苯基的填料，化学物理稳定性好，选择性高，高流速低反压，容易与蛋白质和多肽等生物大分子的表面的疏水性基团作用而结合，不同的分子疏水性不同，与疏水填料的疏水作用力强弱不同，从而分离纯化不同的分子，且填料使用寿命更长。

优选的，洗脱缓冲液A或洗脱缓冲液B的pH均优选为7.2-7.8，更优选为7.5。

优选的，洗脱用缓冲液流速为：线流速50-150cm/h，优选80-120 cm/h，更优选100cm/h。

优选的，所述芳香族疏水层析填料，首先在洗脱液中浸泡2-5h，浸泡后的填料装柱形成层析柱。

本发明相对于现有技术的优势：

1）本发明采用芳香族疏水层析填料，特别是疏水配基为苯基的填料，化学物理稳定性好，选择性高，高流速低反压，容易与蛋白质和多肽等生物大分子的表面的疏水性基团作用而结合，不同的分子疏水性不同，与疏水填料的疏水作用力强弱不同，从而分离纯化不同的分子，且填料使用寿命更长；

2）本发明洗脱液中不含有乙醇，不会影响肠激酶的活性，能够很好的保持肠激酶活性；