[发明专利]一种固定化胰蛋白酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种固定化胰蛋白酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：采用聚合物微球为固定化酶载体，与胰蛋白酶溶液混合，振荡反应，酶分子和载体表面的功能基团产生共价结合，静置，然后再调节pH值至9以上，并维持一定时间，制得固定化胰蛋白酶；

所述的聚合物微球是粒径为150～450μm、表面具有能与胰蛋白酶分子表面的Arg/Lys残基上的氨基进行共价结合的功能基团的树脂微球；

所述的功能基团为环氧基和/或胺基。

2.根据权利要求1所述的固定化胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：

（1）载体的处理：采用聚合物微球为固定化酶载体，水洗以除去漂浮于水面的不合格载体，水洗后抽干；对于功能基团为环氧基的载体，用pH值=7～8、浓度为1～2M的磷酸钾缓冲液润洗，抽干后即可待用；对于功能基团为胺基的载体，通过戊二醛溶液将胺基激活，然后清洗抽干待用；

（2）固定化胰蛋白酶的制备：

①将胰蛋白酶干粉溶于pH值=7～8、浓度为1～2M的磷酸钾缓冲液中，得到胰蛋白酶溶液；往胰蛋白酶溶液中加入步骤（1）处理后得到的载体，得到固定化酶反应液；首先在0～8℃条件下进行振荡反应，促使胰蛋白酶分子均匀扩散至载体孔内外，并与载体的功能基团共价结合；

②振荡反应后于0～8℃条件进行静置反应；

③接着将pH值调节至9～11，于15～25℃条件下继续静置；

④步骤③静置结束后先用pH值=7～8、浓度为1～2M的磷酸钾缓冲液润洗，再水洗至pH值稳定，抽干水分即得到稳定的固定化胰蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：

所述的载体和所述的胰蛋白酶干粉按质量比20:1配比；

步骤（2）①中所述的胰蛋白酶溶液的浓度为5～10mg/mL。

4.根据权利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的通过戊二醛溶液将胺基激活的具体步骤如下：将戊二醛和pH值=7～8、浓度为1～2M的磷酸钾缓冲液混合，得到溶液A；将功能基团为胺基的载体加入到溶液A中，振荡反应。

5.根据权利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：

步骤（2）①中所述的振荡反应的条件为转速为140～160rpm，反应时间为16～28h；

步骤（2）②中所述的静置反应的时间为15～25h；

步骤（2）③中所述的静置的时间为16～24h。

6.一种固定化胰蛋白酶，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。

7.权利要求6所述固定化胰蛋白酶在酶催化反应的应用。

8.根据权利要求7所述固定化胰蛋白酶在酶催化反应的应用，其特征在于：所述的酶催化反应是在有机介质中进行的酶催化反应。