[发明专利]基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片和方法

权利要求书

1.制备芯片的方法，其特征在于，

所述芯片为基于表面活性剂改性的PDMS数字PCR芯片，所述的芯片为基于表面活性剂改性PDMS、无源进样和“三明治”封装结构的数字PCR芯片；微腔阵列区是由微通道衔接各个独立的柱形反应腔；

①所述的表面活性剂改性PDMS是100g PDMS单体中掺杂0.1-1g的表面活性剂，所述的表面活性剂为Triton 100，Tween 20或甜菜碱；直接掺杂在PDMS单体中；固化后表面活性剂聚集在PDMS表面；交联固化后表面活性剂的疏水基团与PDMS结合，亲水基团朝向外侧在PDMS表面形成一层单分子层；PDMS的底面分布有微通道和微反应腔；

②所述的无源进样是利用PDMS天然空气泵的特性将液体样品自动进样和分割成独立反应单元；

③所述的“三明治”封装结构为玻璃-改性PDMS-玻璃夹心结构；“三明治”结构中的玻璃为盖玻片或载玻片，厚度分别为150-570µm；中间有图形结构的PDMS芯片厚度为0.5-2mm；

PDMS芯片是由PDMS预聚体与固化剂按质量比为10:1混合搅匀制成的；

制作步骤包括：

（1）模具的设计与制作

芯片结构是由进样区、阵列区及出样区三部分组成；首先用CAD软件设计图案打印掩膜板，然后利用负性光刻胶SU8 3050在硅片上分层制作微管道和微反应腔；进样区和出样区微管道宽度160微米，进样口到达每条主通道的距离相等，具有相同的流阻，同样的设计宗旨应用在出样区；

（2）PDMS芯片的制备

在上述（1）的硅片模具制作完成后，通过软刻蚀模塑法浇铸PDMS芯片，首先将PDMS预聚体与固化剂按质量比10:1，混合，搅匀，然后再将该混合物按每100g 加入0.1～2.0g表面活性剂的比例再次混合，搅匀，抽真空除气，倾倒于上述模具上，另外在载玻片上薄涂一层同样的混合液PDMS，一起静置1h，固化后将模具上的PDMS剥离，打孔，将有管道面与涂层后的玻璃涂层面贴合在一起，排出贴面中的空气，最后将贴合好的PDMS放入85℃的热板上加热10min，使其完全键合；

（3）液体样品的自动进样和微滴阵列的生成

PCR预混液：此处PCR反应液与常规PCR反应液兼容，所述的PCR反应体系为：20µL预混液中包含10ul Roche 480 Probe Premix，各250nM EGFR基因21外显子上下游引物，200nMTaqMan探针，10ng基因组DNA；

首先制备PCR预混液即样品，将样品注入抽真空脱气后的芯片进样口，利用抽真空后PDMS芯片自身负压作用抽吸样品，样品顺着微通道逐渐注满微通道及其两边的腔体，待所有反应腔中均注满样品后，在进样口注入预先混合的油相，将一小块脱气的PDMS空白块贴在芯片出样口，为油相的导入提供动力，由于油相与水相界面张力的作用，油相进入微管道，将微管道多余样品推出并填充微管道，实现微反应腔的分割，使其成为一个个独立的反应单元，形成圆形微滴阵列，杜绝了样品交叉污染，同时掺了PDMS的油相在热循环初期即受热固化在微调通道内，确保了反应液的稳定性；在油相顺利到达出样口时，揭掉PDMS块，用PDMS封闭进样口及出样口，并盖上盖玻片，防止PCR反应过程中的水分挥发；

（4）PCR扩增

将该芯片立即放入PCR仪上进行在片的原位PCR扩增（in situ PCR），PCR循环程序为：95℃10min预变性，94℃15s，60℃30s循环，15个循环，94℃15s，58℃30s循环，25个循环，共40个循环；采用荧光显微镜观察结果，CCD照相，计数荧光信号阳性微腔。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于芯片阵列区微通道尺寸主干线宽度80微米，衔接主干线和微腔的支线宽度30微米，柱形微反应腔直径100微米，腔与腔之间距离为100微米，腔的总数为10000个，芯片图形结构的高度为100微米。