[发明专利]一种长果安息香DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物DNA提取技术领域，尤其涉及一种长果安息香DNA提取方法。

背景技术

长果安息香(Sinojackia dolichocarpa)又名长果秤锤树，属落叶乔木或灌木，是一种融观花、观果与环保为一体的多功能树种和庭园绿化优良树种，同时也是我国极小种群保护树种。长果安息香主要分布于湖南石门和桑植的局部地区，野外种群数量少。由于长果安息香的分布区域狭小，生长环境独特，植株稀少，且近年来随着植被的破坏，因而，长果安息香的生长环境也随之改变，长果安息香的分布范围也日渐缩减，濒临灭绝。

一般而言，只有在弄清物种的遗传结构和遗传多样性现状的前提下，才能够制定出切实可行的保护策略，否则，任何物种保护措施的实施，都不会取得实质性的成效。分子标记能直接从DNA水平反映物种水平上的遗传差异，是研究植物遗传多样性的有效工具，因此，DNA提取是研究植物遗传多样性的关键环节。

由于次生代谢物的种类极其复杂，不同物种之间的次生代谢物有较大的区别，因此，同一种植物DNA提取方法往往不能很好的应用于不同种类的植物DNA的提取。目前，提取植物DNA的方法很多，最常见的提取方法是SDS(sodium dodecyl sulfate,sodium salt，即十二烷基硫酸钠)法和CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，即十六烷基三甲基溴化铵)法，SDS法和CTAB法均能够对多数植物的DNA进行比较有效的提取。但对某些特定植物，或同一植物的不同器官部位，有的植物适于使用SDS法，有的植物适于使用CTAB法，且SDS法和CTAB法的提取效果有明显差异。然而，目前还没有一种植物DNA提取方法适用于长果安息香的DNA提取。

发明内容

为克服相关技术中存在的问题，本发明提供一种长果安息香DNA提取方法，通过本发明提供的DNA提取方法能够得到完整性好、纯度高的长果安息香DNA。

本发明提供一种长果安息香DNA提取方法，所述DNA提取方法包括：

S01：称取长果安息香放入研钵中，向所述研钵中加入液氮，研磨成粉末，将所述粉末放入离心管中；

S02：向所述离心管中加入体积比为50:1的2×CTAB缓冲液和β-巯基乙醇，混合均匀后形成混合液a；

S03：将所述混合液a放入65℃水浴中温育40-60min，温育后的所述混合液a离心，离心得到的上清液a备用；

S04：根据体积比为10:1混合所述上清液a和NaCl溶液，搅拌均匀后得到混合液b；

S05：根据体积比为1:1混合所述混合液b和溶剂，混匀形成混合液c，所述混合液c离心后留取上清液b，所述溶剂为氯仿与异戊醇的混合溶液；

S06：重复步骤S04-S05，直到无沉淀物，最后一次离心得到的上清液c备用；

S07：向所述上清液c中加入异丙醇，轻轻晃动至絮状物出现，离心，离心得到的沉淀物a备用；

S08：将所述沉淀物a用浓度为75％的酒精洗涤，离心，离心得到的沉淀物b备用；

S09：重复1-2次步骤S07-S08，最后一次离心得到的沉淀物c备用；

S10：向所述沉淀物c中加入体积比为100:1的灭菌NaCl溶液和RNaseA(Ribonuclease,即核糖核酸酶)溶液，混合均匀后置于37℃水浴中消化12-15h，得到混合液d；

S11：根据体积比为1:1混合所述混合液d和冰无水乙醇，慢慢水平转动离心管至产生絮状沉淀，离心，离心得到的沉淀物d备用；

S12：将所述沉淀物d放入离心管中，用浓度为75％的酒精洗涤10min，洗涤完毕后将酒精倒出，留取所述沉淀物d；

S13：向所述离心管中加入无水乙醇，洗涤，洗涤完毕后将酒精倒出，留取所述沉淀物d；

S14：将所述离心管倒置于干燥的灭菌滤纸上，室温干燥至所述沉淀物d透明；

S15：向干燥后的所述沉淀物d中加入TE缓冲液进行溶解，溶解后离心，离心得到的上清液d为长果安息香的DNA溶液，所述上清液d放置于-20℃的冰箱内保存，待用。

优选地，步骤S01中所述2×CTAB缓冲液为65℃预热的2×CTAB缓冲液，以使混合液a进行温育时能够快速达到温育的温度，缩短提取时间。

优选地，步骤S03中所述温育为将所述混合液a放入65℃水浴中40-60min，且每隔5min摇匀一次，以使混合液a中各物质的温育温度相同。