[发明专利]一种多孔磁性铜离子金属螯合载体及其制备方法、利用载体固定化木瓜酶的方法及其应用

权利要求书

1.一种多孔磁性铜离子金属螯合载体，其特征在于，所述载体为以壳聚糖粉末为原料，Fe₃O₄作为磁性材料，SiO₂为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；多孔磁性壳聚糖微球以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备得到多孔磁性铜离子金属螯合载体；多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备方法包括以下步骤：

步骤a，多孔磁性壳聚糖微球载体的制备，向壳聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室温下缓慢搅拌至壳聚糖完全溶解后；加入纳米Fe3O4，搅拌至均匀，加入致孔剂SiO2，搅拌几分钟后，加入液体石蜡，搅拌后升温至50oC，滴加Span80作为乳化剂，乳化至形成壳聚糖液滴，随后升温70oC至温度恒定，调节溶液pH值为9-11，保持为碱性，缓慢的逐滴滴加环氧氯丙烷进行反应；反应后对产物进行洗涤，直至pH值为中性，然后加入NaOH的溶液，80oC的水浴锅加热2h，停止加热后，反复使用蒸馏水进行洗涤，再用稀盐酸洗涤一次，最后蒸馏水洗至中性，得到多孔磁性壳聚糖微球载体，烘干后备用；

步骤b，多孔磁性壳聚糖微球载体的活化，向步骤a中制得的多孔磁性壳聚糖微球中，加入NaOH溶液和环氧氯丙烷，以及二甲基亚砜和硼氢化钠，在40oC恒温反应4h；活化反应后，用去离子水洗涤，去除未反应的环氧氯丙烷和氢氧化钠；

步骤c，多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备，向活化好的多孔磁性壳聚糖微球载体中，加入Na2CO3溶液，再加入亚氨基二乙酸，40oC恒温反应10h；然后将反应产物分散于CuCl2溶液中，25oC恒温反应24h，得到多孔磁性铜离子金属螯合载体；其中，步骤a中乙酸溶液的质量分数为4%；步骤b中二甲基亚砜的体积分数为6%；步骤b中氢氧化钠溶液的浓度为0.6mol/L；步骤b中环氧氯丙烷的体积分数为45%。

2.一种多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备方法，其特征在于，所述方法以壳聚糖粉末为原料，Fe₃O₄作为磁性材料，SiO₂为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；然后，以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备得到多孔磁性铜离子金属螯合载体,所述制备方法包括以下步骤：

步骤a，多孔磁性壳聚糖微球载体的制备，向壳聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室温下缓慢搅拌至壳聚糖完全溶解后；加入纳米Fe₃O₄，搅拌至均匀，加入致孔剂SiO₂，搅拌几分钟后，加入液体石蜡，搅拌后升温至50^oC，滴加Span80作为乳化剂，乳化至形成壳聚糖液滴，随后升温70^oC至温度恒定，调节溶液pH值为9-11，保持为碱性，缓慢的逐滴滴加环氧氯丙烷进行反应；反应后对产物进行洗涤，直至pH值为中性，然后加入NaOH的溶液，80^oC的水浴锅加热2h，停止加热后，反复使用蒸馏水进行洗涤，再用稀盐酸洗涤一次，最后蒸馏水洗至中性，得到多孔磁性壳聚糖微球载体，烘干后备用；

步骤b，多孔磁性壳聚糖微球载体的活化，向步骤a中制得的多孔磁性壳聚糖微球中，加入NaOH溶液和环氧氯丙烷，以及二甲基亚砜和硼氢化钠，在40^oC恒温反应4h；活化反应后，用去离子水洗涤，去除未反应的环氧氯丙烷和氢氧化钠；

步骤c，多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备，向活化好的多孔磁性壳聚糖微球载体中，加入Na₂CO₃溶液，再加入亚氨基二乙酸，40^oC恒温反应10h；然后将反应产物分散于CuCl₂溶液中，25^oC恒温反应24h，得到多孔磁性铜离子金属螯合载体；步骤a中乙酸溶液的质量分数为4%；步骤b中二甲基亚砜的体积分数为6%；步骤b中氢氧化钠溶液的浓度为0.6mol/L；步骤b中环氧氯丙烷的体积分数为45%。

3.一种利用如权利要求1所述的多孔磁性铜离子金属螯合载体固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，向多孔磁性铜离子金属螯合载体中，加入木瓜蛋白酶溶液，室温下振荡3h，用PBS洗涤数次至上清中检测不到酶活，得到固定化的木瓜蛋白酶。