[发明专利]一种从土壤中分离长喙壳菌的方法

权利要求书

1.一种从土壤中分离长喙壳菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)胡萝卜用自来水清洗干净，去表皮后置于乙醇中消毒，用餐巾纸将其表面的乙醇吸干，用解剖刀切成厚度均匀的薄片，之后用打孔器在薄片中央制取相等直径的碟片，备用；

2)将步骤1)中的胡萝卜碟片置于培养皿中，两两重叠，土壤样品置于胡萝卜碟片之间，25～28℃培养3～10天，富集长喙壳菌；

3)用接种环挑取步骤2)中富集的长喙壳菌的子囊壳喙顶端的单个子囊孢子团，在MYEA培养基上划线，25～28℃培养3～5天，挑取单个菌落在新的MYEA培养基上划线，得靶标菌的纯菌落；

4)将步骤3)获得的靶标菌的纯菌落在MYEA培养基上培养2周后，在光学显微镜下观察其菌丝、子囊壳、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形态；另外，刮取菌落表面的菌丝及孢子的混合物，提取总DNA，并进行PCR扩增，并进行序列比对；结合序列鉴定和形态观察结果确定分离到的标靶菌为长喙壳属的真菌；

步骤3)和步骤4)中MYEA培养基的组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂16g/L和100mg/L氯霉素；步骤1)中乙醇的体积浓度为70～75％，消毒时间为1～2min，薄片的厚度为3～5mm，碟片的直径为2.5cm；步骤2)中培养皿的中央放置一团无菌水浸湿的棉花。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中土壤样品的质量为1g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中PCR扩增的引物为：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中靶标菌的形态特征为：菌株能产生芳香性活性挥发物，子囊壳直立生长于培养基上，喙顶端着生子囊孢子团，粘稠、黄色至金黄色，形状不规则；子囊壳棕色至黑色，基部球形，喙修长，喙端孔口菌丝无色透明，呈分散状或聚合状；子囊孢子为典型的帽盔状，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、单生或串生、棕色至浅棕色。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中扩增序列如SEQ ID No.1所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解剖刀、打孔器及接种环用95％的乙醇消毒，并在酒精灯的外焰上反复灼烧2～3遍。