[发明专利]一种猪支原体科特异型单克隆抗体及其在临床检测中的应用

权利要求书

1.一种猪支原体科特异型单克隆抗体，其特征在于：选用猪肺炎支原体做免疫原，筛选出猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，其生物保藏号为CGMCC NO.8011。

2.制备权利要求1所述的一种猪支原体科特异型单克隆抗体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1.选取免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤细胞株

选用猪肺炎支原体(168株)疫苗(生产批号：119052)作免疫原；

S2.免疫动物及免疫

取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml猪肺炎支原体疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别以猪肺炎支原体疫苗追加免疫一次，免疫注射疫苗量和第一次相同，第31天取脾细胞进行细胞融合；

S3.细胞融合及培养

(1)免疫脾细胞的制备；

(2)SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备；

(3)细胞融合；

S4.抗体阳性孔检测；

S5.克隆化；

S6.杂交瘤细胞的冻存；

S7.腹水型单克隆抗体的制备；

S8.单克隆抗体的鉴定(采用ELISA法)

共获得了3株能稳定分泌猪肺炎支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2G2，1A5和1G6，经效价检测，以上3种腹水型单克隆抗体的效价为1×10^﹣4～1×10⁵；特异性检测显示，2G2杂交瘤细胞产生的腹水型单克隆抗体除了猪支原体病外，不和蓝耳病、圆环病、猪瘟、伪狂犬病的病原体发生交叉反应；结果显示，2G2除了与肺炎支原体产生免疫反应外，还能和解脲脲原体起免疫反应。

3.权利要求1所述的猪支原体科特异型单克隆抗体在临床检测中的应用，其特征在于：以所述猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2产生的单克隆抗体为基础，制备了一种猪支原体免疫检测试剂盒。

4.一种猪支原体免疫检测试剂盒，其特征在于：包括样本稀释液25ml、阳性对照液0.5ml～1ml、阴性对照液0.5ml～1ml、猪肺炎支原体单克隆抗体液体2.5ml～3ml、酶标抗体液2.5ml～3ml、显色剂A2.5ml～3ml、显色剂B 0.2～0.4g、洗涤液35ml×4。

5.根据权利要求4所述猪支原体免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为免疫ELISA剂盒。

6.使用权利要求4所述猪支原体免疫检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样本采集：用棉拭子采集病猪口鼻及尿殖道的分泌物，放入采样管内，加入20滴样本稀释液，充分搅动棉拭子，使样本充分游离到稀释液中；

(2)ELISA反应操作步骤

a.将采集有样本的小管按顺序从1到22写上编号；

b.取出24孔培养板，用滴管将样本采集管液按顺序分别加到培养板的小孔内，每个小孔分别加两滴样本液稀释液到1～22小孔，一次可加22个样本，第23号小孔加入阳性对照液两滴，第24号小孔加阴性对照液两滴，在常温下静置40～60分钟，甩去孔内液体；

c.向培养板各小孔加入洗涤液每孔5滴，静置2～3分钟，甩去孔内液体，再重复两次，最后拍干孔内残留液体；

d.向各小孔加猪肺炎支原体单克隆抗体液两滴，在常温下静置20～40分钟，甩去孔内液体；

e.重复c步骤；

f.向各小孔加酶标抗体液各两滴，在常温下静置30～40分钟，甩去孔内液体；

g.同c步骤，但共重复5次；

h.将显色剂A液倒入显色剂B管，拧紧盖子，震荡B管，待粉剂完全溶解后，加到培养板各小孔内，每孔两滴，加液后，常温下避光静置15～20分钟；

(3)结果判定：在白色背景下，观察小孔颜色，如果操作无误，第23号小孔为阳性对照孔应呈橙黄色，第24号小孔为阴性对照孔，应呈无色或接近无色，第1～22号小孔，如呈橙黄色，表明样本为猪肺炎支原体阳性反应，若为无色或接近无色，表明样本为阴性反应。