[发明专利]VRE/MRSA/KPC/NDM‑1检测基因芯片的制备和用途

权利要求书

1.一种VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途，本发明的基因芯片可以用于同时检测5种常见的耐药基因和三种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococci,VRE）的耐药基因VanA、VanB；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的耐药基因mecA；可编码新德里金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase）NDM-1耐药基因；编码碳青霉烯酶KPC基因；以及粪肠球菌特异基因Fddl、屎肠球菌特异基因Sddl和金黄色葡萄球菌特异基因nuc；

其特征是包含（1）检测上述基因的8对特异性引物和2对细菌内标引物；（2）8条耐药基因特异性寡核苷酸探针；（3）芯片质量控制寡核苷酸探针；；（4）寡核苷酸探针固化在载体材料上形成的探针阵列；；

所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚寡核苷酸，长度在27-42nt；

所谓的特异性引物是指根据基因序列的保守区设计的寡核苷酸，可以扩增出特异性基因，长度在18-25nt；

所谓的质量控制寡核苷酸探针至少包括两种探针，即阳性对照，阴性对照：阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位，阴性对照用于检测杂交信号错误或污染；

所谓的载体材料选自玻片、金属片、硅片、硝酸纤维素；

表1 特异性扩增引物

表2 特异性寡核苷酸探针序列

。

2.如权利要求1所述的检测基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

设计特异性引物和探针：以8种特异性基因为靶，从中选取权利要求1所述的引物及探针序列；

合成探针：使用DNA合成仪合成；

引物处理：反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素；

探针处理：在3’或5’末端加上polyT尾巴，并进行氨基修饰，使它能够固化在基质上；

基因芯片的制备：使用点样仪在基质上按预先设定好的顺序进行点样；

将点好的芯片在室温放置干燥18小时以上，使探针牢固固定在基质上。

3.DNA芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：

（1）步骤一，细菌基因组DNA的提取，使用市售商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

（2）步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用多重PCR体系，将整个扩增体系分为A、B两管；A管包括VanA、VanB、Fddl、Sddl、内标16s1；B管包括mecA、nuc、NDM-1、KPC、内标16s2；扩增按以下循环参数进行扩增：95℃预变性15 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃，30 s，共40个循环；72℃延伸5 min；4℃保存或进行下一步实验；

（3）步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2% SDS和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产物2.5μL和B管产物2.5μL与5μL杂交液混匀，加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；

（4）步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2%SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30s,最后将基因芯片表面液体离心干燥；

（5）步骤五，样品标记：向芯片加入10μL标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；

（6）步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚1:1混合的化学发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；

（7）步骤七，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析；

每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值>该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。

4.根据权利要求3所述的VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求2中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。