[发明专利]一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法

权利要求书

1.一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于，包括：

利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；

利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；

利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；

利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；

利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，以便得到冻存的免疫细胞；

将所述冻存的免疫细胞置于37-42℃水浴中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液；以及

将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏的免疫细胞，

其中，

所述免疫细胞激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；

所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；

所述免疫细胞规模化扩增培养基为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基；

所述免疫细胞冻存液包含2-10体积％的DMSO、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基；

所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；

所述沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml，

所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml，

所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述无血清淋巴细胞培养基均为OpTmizer ^TMCTS^TM无血清培养基或SuperCulture ^TML500人淋巴细胞无血清培养基，

所述免疫细胞激活培养基中，所述第一血浆的浓度为7-13体积％；

所述冻存培养基为1640培养基或Stemspan培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一血浆和所述第二血浆均为自体血浆。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞冻存液中，

所述DMSO的浓度为10体积％；

所述HSA的浓度为5体积％；

所述第二血浆的浓度为40体积％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷冻复苏液中，所述白蛋白为人白蛋白，任选地，所述人白蛋白来源于市售人血清白蛋白或自体血浆，

任选地，所述白蛋白的含量为1-5％，

任选地，所述右旋糖酐为右旋糖酐40，

任选地，所述右旋糖酐的含量为2-8重量％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述初步诱导扩增的免疫细胞的CD56的表达超过70％时，进行所述第二诱导扩增培养，

任选地，当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90％时，进行所述第三诱导扩增培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一诱导扩增培养过程中，每1天传代一次，

任选地，所述第二诱导扩增培养过程中，每2天传代一次，

任选地，所述第三诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每10⁶-10⁹个所述大规模的功能激活的免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻存的免疫细胞融化后与所述冷冻复苏液混合的体积比为1：0.5-5。