[发明专利]一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种纤维蛋白原定量检测试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，其特征在于，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。

3.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光化学底物为AMPPD，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述磁珠的内核为四氧化三铁，其粒径为0.3～1.0μm。

4.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠由以下步骤制得：

a)将磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为50～80mg/mL；

b)用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为12～24mg/mL；

c)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于步骤b)所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；

d)将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为25～45mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭2～4小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为8～22mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠；

所述辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体由以下步骤制得：

S1、将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液；将得到的混合溶液装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；

S2、向透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为8.5～9.0，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体，混匀，室温下避光搅拌反应；

S3、向所述步骤S2得到的反应产物中加入NaBH₄溶液，混匀，静置反应，将反应得到的反应产物装入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜后取出，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃上清；将沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤后，将沉淀物溶于PBS缓冲液中后装入透析袋中透析去除铵离子后，将溶液离心，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后混匀分装，冰冻保存。

5.如权利要求1～4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括纤维蛋白原标准品、样品稀释液和洗涤液PBST。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有1.5mg/ml的甘油和0.08mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。

8.一种利用如权利要求1～7任一所述的试剂盒定量检测纤维蛋白原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)用样品稀释液将待检样品稀释至10～15μg/ml，取上述稀释后的待测样品置于反应杯中，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠，室温孵育20～30min后，加入辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体，室温孵育20～30min；

B)分离磁珠，并用洗涤液洗涤后加入发光化学底物，作用10～30min，测定其发光强度；

C)根据标准品中纤维蛋白原的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样品光强度在标准曲线上相对应的浓度值即为待测样品中纤维蛋白原的测定浓度。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A)还包括在待测样品中加入分散剂或者在加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠后加入分散剂的步骤。