[发明专利]去糖化的海参次级皂苷及其制备方法

说明书

本发明提供了去糖化的海参次级皂苷及其制备方法，去糖化的海参次级皂苷是海参皂苷HA和海参皂EA的糖链上由于糖苷酶酶解脱去后两个糖基后得到的次级皂苷；该次级皂苷的制备方法包括：乙醇浸提、大孔树脂粗提，再利用硅胶柱进行纯化，分别得到HA和EA，最后利用糖苷酶进行酶解，即能够分别得到去糖化的HA和EA次级皂苷。本发明所使用的糖苷酶在温和的条件下将海参皂苷酶解成次级皂苷，从而降低海参皂苷的毒性，提高其生物活性；同时，使用糖苷酶酶解海参皂苷，避免了使用微生物降解或从微生物中提取的粗酶进行降解而带来的副反应及副产物，提高了酶解产物的纯度和产量，可以得到单一产物，纯度可达100%。

技术领域

本发明涉及一种海参皂苷的酶解制备方法，具体涉及利用糖苷酶酶解海参皂苷的方法，最终得到脱除两个糖基的海参次级皂苷。

背景技术

海参为棘皮动物门、海参纲、楯手目动物。海参皂苷是海参体内重要的次生代谢产物同时也是重要的活性物质，海参皂苷主要活性作用——抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗衰老以及溶血作用，还有调节特定细胞的生长发育和免疫调节等作用。因此，海参皂苷是海参药用价值的重要指标。

皂苷具有溶血作用，皂苷可与红细胞膜结合形成甾醇复合物，从而导致通透性增加，造成血红蛋白的流失。这一性质增加了皂苷的毒性，阻碍其药用价值的发挥。YibingWang等人研究发现植物皂苷的溶血活性与其分子结构有很大关系——相同苷元，糖链上糖基个数越多溶血活性越强；相同糖基个数，但糖基之间连接方式不同溶血活性也不同，如双糖以(1-2)-，(1-4)-，(1-6)-方式连接的皂苷，其溶血性依次增强；糖基上的乙酰化降低皂苷溶血活性。Han M等人进行体内、体外实验表明，一些糖基化的大量皂苷，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc，在小肠内吸收非常微弱，而一些脱糖基化的稀有皂苷，则更容易作为在体内发挥作用的活性成分被吸收到血液系统中。并且一些稀有人参皂苷，例如Rg₃、Rh₂、Rh₁、化合物C-K及人参苷元等较未降解前的人参皂苷具有更好的肿瘤细胞毒活性。

海参皂苷的溶血活性比人参皂苷还要强，主要原因可能是海参皂苷的化学结构比人参皂苷复杂，尤其是C-3位置的糖链结构的差异。董平等人通过酸水解海参皂苷并研究其活性时发现天然状态下存在的皂苷成分，溶解生物膜的功效更强，当糖链部分少于2个单糖时，其溶血活性会急剧降低，当糖链部分含有1个单糖的皂苷或者无糖链的苷元，溶血作用很小，在浓度高达200 mg / L时，仍不能使红细胞完全溶解。学者Kalinin等的研究结果表明：海参皂苷末端为3-O-MeGlc时可促进K⁺的流失，而其C-4硫酸酯化后则可降低溶血作用，并降低K⁺流失的速率。

目前，对皂苷的降解方法主要包括化学降解法和酶及微生物降解法。酸水解是最常用，也是操作最为简便易行的皂苷降解方法。强酸水解可以将糖链部分或全部降解掉，得到苷元，但是反应过于激烈，容易发生侧链的脱水、环和、双键位移等不理想的产物。温和酸水解往往可以得到多种糖链长度不同的次级苷，部分次级苷相对于皂苷会发生构型的转变。皂苷类化合物分子结构中的糖苷键在碱水溶液中降解较难进行，因此通常需要提高反应温度等加以实验。酶水解具有一定的专属性，不同性质的酶作用于不同构型、不同组成糖的糖苷键，从而达到定向水解的目的，是最理想的制备次级皂苷的方法。

目前，有很多关于通过酶解作用将高含量的人参皂苷转化成高活性的稀有人参皂苷的报道，例如，高娟等人通过糖苷酶酶解Rb1制备次级苷Rg₃、Rh₂、Rh₁、化合物CK等次级皂苷，并且有研究证明这些稀有人参皂苷具有更好的抗肿瘤细胞毒活性等生物活性。

然而，对海参皂苷酶解的相关研究很少，因此高娟论文中酶解方法对研究糖苷酶对海参皂苷的酶解作用有非常好的借鉴和指导意义。常用化学方法水解皂苷，但是具有副反应多，产物杂，专一性差等缺点。因此研究新的酶解海参皂苷方法，可以丰富海参皂苷的结构，尤其是非天然存在或在海参体内含量很少的结构类型，为海参皂苷结构、活性等方面的理论和应用研究奠定基础。

发明内容