[发明专利]一种菰cDNA文库的构建方法

权利要求书

1.一种菰cDNA文库的构建方法，其特征在于，通过SMART法，利用反转录酶PowerScriptRT的末端转移酶活性来实现cDNA反转录；

对杂交后的cDNA利用不同浓度梯度的DSN进行消化，富集低丰度表达基因；

所述方法包括如下步骤：

S1、菰总RNA获得；

S2、cDNA第一链合成；

S3、LD PCR；

S4、蛋白酶K消化；

S5、cDNA文库均一化：

S51、杂交；

S52、DSN消化；

S6、DSN消化后两次PCR放大；

S7、扩增产物纯化；

S8、Sfi I消化；

S9、酶切cDNA纯化；

S10、cDNA与PUC19载体连接；

S11、质粒的转化；

S12、克隆鉴定；

S2具体包括如下步骤：

a.在PCR管中加入以下试剂：

b.72℃温浴2min；

c.冰浴2min，离心后加入下列试剂：

d.42℃温浴1h；

其中，CDS III的序列为：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TGGCCGAGGCGGCCd(T)₂₀VN-3'；N＝A,C,G or T；V＝A,G or C；

S52具体包括如下步骤：

a.设置不同浓度的DSN酶：

①将DSN storage buffer和DSN酶等体积混匀，标记为1/2DSN；

②将3倍体积的DSN storage buffer和1倍体积的DSN酶混匀，标记为1/4DSN；

③DSN storage buffer，标记为control；

④DSN酶，标记为DSN；

b.68℃预热DSN master buffer；

c.依次加入下列试剂后，混匀；

d.将4个PCR管68℃反应25min；

e.在各管中加入2×DSN stop buffer，混匀；

f.室温放置5min；

g.-20℃保存；

S6具体包括如下步骤：

S61、第一次放大

a.分别向S52得到的四个消化后产物中加入以下试剂，混匀；

其中，Primer M1为5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

b.PCR：95℃ 1min；95℃ 15sec、66℃ 20sec、72℃ 3min，11cycles；

c.从各管中分别取PCR产物进行电泳检测；

d.根据电泳结果，选择条带大小为1000-2000bp、亮度一致、分散均匀的产物为模板进行第二次放大；

S6具体包括如下步骤：

S62、第二次放大

a.在两个PCR管中依次加入以下试剂，混匀；

其中，Primer M2为5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-3’；

b.PCR：

c.取PCR产物进行电泳检测。