[发明专利]一种羰基还原酶突变体及其在手性醇制备中的应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其在手性醇制备中的应用。一种羰基还原酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种用于生产羰基还原酶的基因工程菌，并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组羰基还原酶的制备，并将其用于不对称催化合成(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯。

技术领域

本发明属于生物工程技术及生物医药领域，涉及一种羰基还原酶及其在手性醇制备中的应用,具体涉及一种羰基还原酶及其基因，及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成普利类药物重要手性中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。

背景技术

普利类药物是重要的抗高血压药物，其含有的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)可作用于肾素-血管紧张素系统RAS，并显著抑制其中的血管紧张素转化酶的产生，从而减少血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的生成并使血压下降，达到控制血压、保护靶器官的作用，可用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病。

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenyl-butyrate,(R)-HPBE)，CAS号90315-82-5)是合成多种血管紧张肽转化酶抑制剂(ACEⅠ)和充血性心力衰竭药物的重要手性中间体，其研究具有较大的实用意义和工业应用前景。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是一种手性仲醇，为无色透明油状液体，不溶于水，易溶于氯仿，乙酸乙酯等有机溶剂，沸点212℃，相对密度1.075，分子式C₁₂H₁₆O₃，分子量208.25。

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成方法包括化学法和生物法，生物法又分为生物拆分法和生物还原法，其中生物法合成(R)-HPBE具有对环境污染小，反应条件温和等优点，具有很好的工业应用效果。

发明内容

本发明提供了一种制备羰基还原酶的方法，并发明了应用该酶催化合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯等光学活性手性醇的方法。

本发明提供一种具有较高催化活性、对映选择性和较好底物耐受性的羰基还原酶，及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成普利类药物重要手性中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。

本发明提供一种羰基还原酶突变体，其是(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(2)或是由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(1)衍生的蛋白质。

本发明的羰基还原酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其野生型基因序列来自光滑假丝酵母Candida glabrata CBS 138，经过易错PCR方法对其进行突变得到。本发明羰基还原酶突变体基因可以通过PCR扩增法、重组法或者化学合成方法获得。

本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒pUC18，pUC19，pBV322，pBAD，pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-28a。

本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的羰基还原酶基因或其重组表达载体的基因工程菌，本发明优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。