[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。葡萄糖脱氢酶突变体基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌。并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组葡萄糖脱氢酶的制备。本发明提供一种催化活性、pH及热稳定性、有机溶剂耐受性较好的葡萄糖脱氢酶突变体，可用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

氧化还原酶被广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸等药物中间体，绝大多数氧化还原反应都需要辅酶NAD(P)H的参与。因辅酶价格昂贵，稳定性差、难以重复利用，严重限制了氧化还原酶的工业化应用，构建高效、经济的辅酶再生体系对于解除辅酶含量对反应的限制、降低生产成本极为重要。

辅酶再生的方法可分为全细胞法、光化学法、化学法、电化学法和酶法等。酶法再生还原态辅酶由于对辅酶的选择性及再生效率高，且再生系统与合成系统兼容性好，因而最受青睐。

葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH，EC 1.1.1.47)属于短链醇脱氢酶家族，由4个相同的亚基组成，广泛存在于原核与真核生物中。葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅酶可分为三种类型：吡咯喹啉醌依赖型、FAD依赖型及NAD(P)⁺依赖型。其中NAD(P)⁺依赖型葡萄糖脱氢酶可特异性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，同时将NAD(P)⁺转化为NAD(P)H，从而解决NADH以及更为昂贵的NADPH的再生问题。由于其对辅酶NAD(P)⁺的比活高，对还原性辅酶NAD(P)H的再生能力强，且既可用于NADH的再生，又可用于NADPH的再生，NAD(P)⁺依赖型葡萄糖脱氢酶得到了广泛的应用。该酶可从多种微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等中获得。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种葡萄糖脱氢酶突变体。

本发明的另一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法。

本发明的又一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

葡萄糖脱氢酶突变体基因，其野生型基因其来源为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis T1(GenBank:KU682779.1)，根据易错PCR方法对其进行突变，从而获得该氨基转移酶突变体目的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒pUC18，pUC19，pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-28a。

一种生产所述的葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或本发明所述的重组载体。

所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

所述基因工程菌优选保藏号为CCTCC M 2016059的E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。