[发明专利]一种合成含有分子内二硫键的多肽的新工艺

说明书

本发明属于多肽化学合成技术领域，特别涉及含有分子内二硫键的多肽的合成方法。此方法包括一种直接对线性多肽粗品的反相高效液相色谱纯化组分进行氧化的策略，在这种策略中，首先对多肽线性粗品通过反相高效液相色谱进行纯化，得到的纯化组分直接进行氧化。氧化多肽溶液通过浓缩后再次通过反相高效液相色谱进行纯化，最终经冷冻干燥后得到目标多肽的纯品。此方法有效避免了多肽线性粗品中某些杂质对氧化产物纯度的干扰，可有效提高最终产物的纯度和综合收率。与常规合成方法相比生产流程得到了简化，避免了多肽的反复冷冻干燥和溶解过程，在更好的保护多肽产品品质的同时，提高了分子内二硫键多肽大规模生产的可行性。

技术领域

本发明关于一种制备序列中含有分子内二硫键的多肽的新方法，尤其适用于线性多肽合成效果不佳、对最终产品纯度要求较高并有大规模生产需求的多肽序列，和用这种方法得到的产物。

背景技术

多肽是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的一类化合物，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。并且，从动物、植物和微生物等生物体中分离提取多肽极受来源的限制，多肽的化学合成则具有更光明的工业化前景。近年来对多肽研究的热点已转移到环肽的合成和生物评价上，而通过二硫键形成环肽是非常方便的一种途径,。在许多重要的胞外多肽和蛋白质分子如包括激素、酶、生长因子、毒素、免疫球蛋白，二硫键在分子折叠和稳定结构方面发挥着至关重要的作用。而且，人为地引入一些二硫键可以对多肽或蛋白质的构象进行进一步约束，可以达到提高其生物活性或热力学稳定性的目的。也正是由于这类大分子环肽具有相对明确的特定构象，所以他们能够更好地与受体进行选择性结合，其代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。鉴于以上二硫键的这些优势，含有二硫键的多肽的化学合成长期以来一直引起科学家的广泛兴趣。

对于多肽分子内二硫键来说，构象方面的因素如多肽链长度、二硫键间氨基酸残基的种类及个数等对二硫键形成的难易程度影响尤其重要；而生产工艺的选择，如合成中半胱氨酸(Cys)侧链巯基保护基团、氧化条件以及纯化工艺的选择等，也对二硫键多肽的生产效率影响显著。通常的合成工艺中，主要采用三苯甲基(Trt)或乙酰氨甲基(Acm)作为半胱氨酸的侧链巯基保护基团，通过传统Fmoc/tBu固相合成法合成直链肽,再经碘(I2)或者二甲亚砜(DMSO)氧化肽链上两个半胱氨酸的巯基，生成分子内二硫键而得到目标环肽。线性肽成环属于分子内反应，为避免发生分子间反应生成线性或环状的二聚和多聚体，一般在高度稀释的溶液(10^-3～10^-4mol/L)中进行。近年来也有在固相中成环的报道，即在完成整个多肽链的合成后不进行切割直接在树脂上进行氧化成环，利用的是固相材料的“假稀释”作用来避免分子间的二聚和多聚副反应，此策略的优势在于不需要在高度稀释的溶液中进行氧化，并且过量的氧化试剂及某些小分子副产物可通过洗涤与过滤除去。但是这种策略中，进行切割时切割试剂的选择会受限于多肽中二硫键的存在，导致一些氨基酸残基存在发生副反应的风险，从而使得粗肽纯度降低，最终将影响纯化收率以及终产物的纯度。所以在多肽生产中，多肽在溶液中进行氧化仍是制备二硫键多肽的主要方法之一。