[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用

说明书

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，该猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。本发明的自然致弱毒株制备的疫苗组合物能够对猪体产生完全保护，其生物安全性好，不存在毒力返强的风险。

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、致弱的病毒株及利用该毒株制备的疫苗组合物，属于兽用生物制品领域。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。

最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间(参见猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.彭金美等.中国预防兽医学报，2013，35(1)：1-4；免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.童武等.中国动物传染病学报，2013,21(3):1-7；PathogenicPseudorabies Virus,China,2012.Yu et al.,Emerging infectious Diseases.2014,20(1):102-104；Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs,China,Anet al.,Emerging infectious Diseases.2013.19(11)：1749-1755，临床上需要针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病的疫苗。

预防和控制猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病有效的方法是疫苗接种，开发商品化的疫苗可以是灭活疫苗，也可以是弱毒株制备的活疫苗。然而，灭活疫苗成本较高，活疫苗一般是通过基因工程手段人工缺失毒力基因致弱毒株来制备的，存在生物安全风险。因此，临床上存在提供安全性高的弱毒疫苗株以预防猪伪狂犬变异株感染蔓延的需要。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过细胞传代、结合诱变剂诱变的方式，自然致弱毒株，使其在自然进化过程中发生变异，达到完全适应自然环境条件，以保证该致弱株的稳定性，不存在生物安全方面的风险。

本发明的一个方面在于提供一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。本发明的弱毒株为自然致弱，生物安全性好，不存在毒力返强的风险。

本发明的一个方面在于提供一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：(1)培养胸腺激酶缺陷传代细胞，同步加入5-溴-2’-脱氧尿苷(BUdR)，形成良好单层；(2)将猪伪狂犬病病毒接种生长良好的上述传代细胞单层，同步加入BUdR，继续传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。

本发明的一个方面在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有免疫量的所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株或其培养物，以及药学上可以接受的载体。