[发明专利]标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法。本发明利用内源瓜氨酸化抗原与ACPA可以形成抗原抗体免疫复合物的原理，寻找和摸索一种瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，不仅可以反映ACPA的水平，还可以反映瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物与疾病状态相关联，其量的变化可以直接反映病情的进展情况和治疗的效果评价，以实现快速、准确、方便诊断和评价RA的目的。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种主要以关节滑膜炎症反应为病理改变的慢性自身免疫性疾病。RA的病变过程与患者体内产生多种自身抗体并与相应抗原形成抗原抗体免疫复合物(ICs)密切相关，部分循环中的ICs可反复沉积于关节滑膜组织，通过激活补体系统级联反应引起滑膜炎症，造成关节损伤。RA患者关节液和血清中的ICs可促进软骨细胞的生长、NO的生成和细胞凋亡，提示ICs在RA发病中扮演着重要的作用。ICs在RA检测中具有较高的敏感性，ICs持续增高常提示RA患者预后较差。

只有含有IgG和IgM类抗体的复合物才能活化补体的经典途径而引起炎症。这两类抗体在血清中含量较大，是构成免疫复合物的主要抗体；可溶性抗原与相应抗体形成的较大免疫复合物活化补体的能力较强。IgG抗体为双价，可与相应的多价抗原交互结合形成较大的免疫复合物；IgM分子可形成更大的免疫复合物。抗原－抗体亲和力高时易形成大而稳定的免疫复合物。RA患者关节液和血清中存在较高水平的瓜氨酸肽与ACPA形成的免疫复合物，正常情况下，抗原抗体复合物在机体中被吞噬清除，然而在病例状态下，ICs可诱发炎症反应。

RA发病过程中伴随多种免疫活性细胞如T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synovicyte,FLS)和中性粒细胞等的活化及细胞因子(IL6、TNF-α)、趋化因子和炎性介质的释放。RA FLS增殖与局部关节炎症和血管翳形成、骨破坏密切相关，FLS增殖和细胞因子分泌异常在RA发病过程中发挥关键作用。RA血清中存在含有瓜氨酸化蛋白与ACPA的ICs具有促FLS增殖能力，并可刺激FLS分泌更多细胞因子，参与RA发病机制。

自身免疫性是类风湿关节炎的主要特征,最佳例证是血浆中可检测出高滴度的自身抗体,其中研究最为透彻的是类风湿因子(rheumatoid factors，RF)，但RF不只在RA中出现,也可见于正常人,并在其他一些疾病中升高。近年来，抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)虽然在RA常规诊断中尚未完全取代RF的地位，但其已成为诊断RA的首选指标。总体而言，ACPA与RF敏感性相近，但特异性更高。这些抗体识别转录后被瓜氨酸化的多种蛋白，包括聚丝蛋白(filaggrin)、波形蛋白(vimentin)、α和β纤维蛋白(α-andβ-fibrin)、α-烯醇化酶(α-enolase)及I型和Ⅱ型胶原多肽(Type I andtype Ⅱcollagen)。

ACPA的检测是通过ELISA法检测血清对环瓜氨酸多肽(CCP)的反应。最初的临床检验以检测抗瓜氨酸化聚丝蛋白的环状多肽的反应为基础，因为环瓜氨酸多肽与天然构象表位更为接近，从而提高的实验结果的准确性。目前这一实验已被结果更准确的第二代试验——抗CCP2Elisa——所取代，它使用从瓜氨酸化多肽库中筛选的瓜氨酸化多肽，这些瓜氨酸化的多肽均为人工合成。近期研究显示瓜氨酸化残基可在肺和滑膜表达，ACPA的产生可能为肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidylarginine deiminase，PAD)介导的蛋白在肺及滑膜脱亚氨基作用而致。这些蛋白可被特异性抗原递呈细胞或通过B细胞形成的免疫复合物所摄取，并递呈给T细胞，促进激活ACPA反应性B细胞。

目前关于RF的检测特异性较低；采用人工合成瓜氨酸化多肽用于ACPA的检测，仅可以反映自生抗体的水平，且ACPA水平未必与疾病状态相关联。