[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用

权利要求书

1.一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，以猪伪狂犬病病毒HN1201株的TK基因为基准，所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因101～102位之间发生1个碱基的插入；优选地，所述插入的碱基为C。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒为猪伪狂犬病病毒变异株，所述猪伪狂犬病病毒变异株包括HN1201株、HN1202株、HN1201-R株；所述猪伪狂犬病病毒HN1201株的自然致弱毒株为HN1201-TK[101-C-102nt]⁺株，所述猪伪狂犬病病毒HN1202株的自然致弱毒株为HN1202-TK[101-C-102nt]⁺株，所述猪伪狂犬病病毒HN1201-R株的自然致弱毒株为HN1201-R2株。

3.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述HN1201-R2株或其培养物，和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述HN1201-R2株的培养物为传代1～102代的培养物。

5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述HN1201-R2株含量为≥10^6.0TCID₅₀/头份；优选地，所述HN1201-R2株含量为10^6.0TCID₅₀/头份～10^7.0TCID₅₀/头份。

6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括稳定剂，所述稳定剂包括SPGA、糖类、蛋白质，含有蛋白质的物质，或缓冲液；糖类包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质包括白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质包括牛血清或脱脂乳，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括免疫量的其他抗原，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原；优选地，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。

8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括佐剂，所述佐剂包括弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、矿物油、植物油或Carbopol。

9.权利要求1所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株的制备方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)取生长良好的143TK^-细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液、3％～10％体积比的胎牛血清和50μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的细胞培养液，所述细胞培养液pH为7.0～8.0，在36℃～38℃，5％CO₂条件下继续培养，形成单层143TK^-细胞；

步骤(2)接种猪伪狂犬病病毒HN1201株到所述步骤(1)培养的单层143TK^-细胞，用含有50μg/ml BUdR及95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞维持液，所述细胞维持液pH为7.1～7.5，在36℃～38℃，5％CO₂条件下继续培养，在68h～72h后，当细胞80％以上发生病变时，收获感染病毒的细胞及上清液，-80℃反复冻融3次后，收获病毒；以及

步骤(3)按照所述步骤(2)的方法再传7代，然后将收获的病毒接种于143TK^-细胞，用含50μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的低熔点琼脂糖平皿培养，所述低熔点琼脂糖平皿由含4％胎牛血清的2×DMEM与2％琼脂糖按照体积比1:1混合而成，待出现蚀斑后，挑取单个蚀斑到DMEM培养液中培养。

10.权利要求3～8所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用；优选地，所述的猪伪狂犬感染相关疾病是由猪伪狂犬病病毒变异株导致的猪伪狂犬病。