[发明专利]一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种提高记忆的从血浆分离的混合物，其特征在于：所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括11条肉眼清晰可见的条带，分子量大小分别为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；

所述混合物的制备方法依次包括以下步骤：血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心、阴离子交换、第一次浓缩、分子筛、透析、第二次浓缩步骤；

在所述低温过滤步骤中，在压力条件下将所述血浆进行过滤，得到滤液；其中，所述过滤使用的滤膜的孔径为0.22微米或0.45微米；

在所述低温超滤步骤中，将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤，得到截留在膜内的液体作为低温超滤产物；所述膜包截留分子量为3kD-10kD，所述膜包超滤使用的缓冲液为180mM、pH值为8.0的Tris-盐酸缓冲液；

在所述冷乙醇沉淀步骤中，将所述低温超滤产物与冷乙醇混合后静置，取上清液，作为冷乙醇沉淀产物；所述冷乙醇和所述低温超滤产物的体积比为1：(4-8)；

在所述SD灭活步骤中，将所述冷乙醇沉淀产物用浓SD灭活剂重新悬浮后静置，得到灭活产物；所述静置温度为4～37℃，时间为6～18小时；所述浓SD灭活剂含有0.6-4％的N-丁基三磷酸盐、1-4％的吐温；

在所述离心步骤中，将所述灭活产物离心后保留上清液，得到离心分离产物；所述离心中，离心力为2000-10000g，时间为10-20分钟，温度为0-8℃；

在所述阴离子交换步骤中，将所述离心分离产物加入阴离子交换柱中进行步级洗脱，所述步级洗脱中，先用第一次洗脱缓冲液洗脱，得到第一次洗脱液；再用第二次洗脱缓冲液洗脱，得到废液；再用第三次洗脱缓冲液洗脱，得到第三次洗脱液；合并所述第一次洗脱液和第三次洗脱液，得到阴离子交换产物；所述第一次洗脱液缓冲液中含有50-100mM的氯化钠，所述第二次洗脱液缓冲液含有250-300mM的氯化钠，所述第三次洗脱液缓冲液含有450-500mM的氯化钠；所述第一次洗脱缓冲液、第二次洗脱缓冲液、第三次洗脱缓冲液均为浓度100mM、pH值8.0的Tris-盐酸缓冲液；

所述第一次浓缩步骤中，将所述阴离子交换产物进行浓缩，得到第一次浓缩产物；所述第一次浓缩产物的体积为500微升-10毫升；所述浓缩是采用浓缩管离心，所述浓缩管允许1.0-2.5KD的物质通过；或者所述浓缩是采用浓缩杯加压，所述浓缩杯允许1.0-2.5KD的物质通过；

所述分子筛步骤中，将所述第一次浓缩产物在分子筛中洗脱，得到分子筛产物；所述洗脱的洗脱缓冲液中含有20-500mM的氯化钠；所述洗脱缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，浓度为1mM，pH值为8.0；开始收集洗脱液时的洗脱体积为20ml，停止收集洗脱液时的洗脱体积为85ml；

在所述透析步骤中，将所述分子筛产物进行透析，收集透析容器中的产物得到透析产物；所述透析使用的透析缓冲液为1-20mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；所述透析的时间为20-72h；所述透析的体积比是1:(100-10000)；

在所述第二次浓缩步骤中，将所述透析产物进行第二次浓缩，得到第二次浓缩产物，即为所述混合物；所述透析产物的体积是所述浓缩产物的20-100倍；所述浓缩是采用浓缩管离心，所述浓缩管允许1.0-2.5KD的物质通过；或者所述浓缩是采用浓缩杯加压，所述浓缩杯允许1.0-2.5KD的物质通过；

通过蛋白质谱分析，所述混合物中至少含有105种蛋白；

所述105种蛋白为：

14-3-3蛋白ζ/δ、14-3-3蛋白质ε、40S核糖体蛋白S15、AP-4复合物亚基β-1、BPI折叠的家族B成员1、BPI折叠家族B成员2、DNA修复支架蛋白、Hemicentin-1的同种型2、HORMA结构域蛋白2、Igλ链、LVV-血管肽-7、L-乳酸脱氢酶B链、MOB激酶活化剂1B、NAD(P)转氢酶、RhoGDP-解离抑制剂2、SLIT-NTRK样蛋白4、S-腺苷甲硫氨酸合酶、TNFSF4蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-2-糖蛋白1、γ-烯醇化酶、δLf乳转铁蛋白、玻连蛋白、博来霉素水解酶、补体C1q亚组分亚基C、补体C3、翅芽启动因子同源物、触珠蛋白、催乳素诱导蛋白、蛋白argonaute-3的同种型2、蛋白S100-A9、二甲基苯胺单加氧酶2、泛素-60S核糖体蛋白L40、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、富酪蛋白、富唾液酸性脯氨酸磷蛋白1/2、肝细胞生长因子样蛋白、谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶E、谷胱甘肽S-转移酶P、谷胱甘肽过氧化物酶3、光蛋白聚糖、果糖二磷酸醛缩酶A、过位点蛋白2、过氧化物酶体膜蛋白PMP34、过氧物毒素2、核受体共活化剂1、琥珀酰-CoA连接酶亚基α、肌动蛋白-1、基本唾液富含脯氨酸蛋白2、甲状腺素结合球蛋白、钾电压门控离子通道、碱性肽IB-6、结合高铁血红蛋白、精氨基琥珀酸合酶、聚合免疫球蛋白受体、赖氨酸-tRNA连接酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶、磷酸性簇排序蛋白2、酶原颗粒蛋白16同源物B、霉素、膜联蛋白、脑酸可溶性蛋白1、凝血酶2、凝血因子XIII B链、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶、前纤维蛋白同种型CRA_b、桥粒斑蛋白、桥粒芯糖蛋白-1、人源性激肽释放酶结合蛋白、溶菌酶C、乳过氧化物酶、乳腺珠蛋白-B、色素上皮衍生因子、上池蛋白、肾囊素-3、视黄醇结合蛋白4、双功能3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸合酶1、丝氨酸蛋白酶抑制剂B12、丝聚蛋白、髓过氧化物酶的同工型H14、胎球蛋白B、微管蛋白α-1A链、维生素D结合蛋白、烯醇化酶-磷酸酶E1的同种型2、细胞外基质蛋白1、纤溶酶原、锌-α-2-糖蛋白、锌指蛋白DZIP1L的同种型2、锌转运体、性激素结合球蛋白、血红蛋白、血浆激肽释放酶、血浆铜蓝蛋白、血清铁蛋白、血小板亲和蛋白、血小板亲和蛋白2的同种型1、原蛋白脂肪3、载脂蛋白A、粘蛋白-5B、脂笼蛋白1样蛋白1、中性粒细胞防御素1、转化生长因子β受体相关蛋白1、组织蛋白酶D。