[发明专利]重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L‑苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。本发明得到重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达12.4g/L，糖酸转化率可达16.2％，且在发酵培养过程中无副产物乙酸形成。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸(Thr)是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素-单酰胺菌素的原料。

目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。2016年梅花集团申请的中国专利201610119758.6中，通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。本发明提供的重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达12.4g/L，糖酸转化率可达16.2％。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组菌株，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。本领域技术人员认为可行的其它可强化pntAB基因的方法同样在本发明的保护范围之内。

作为优选，pyc基因的来源为谷氨酸棒状杆菌。本领域技术人员认为可行的其它来源的pyc基因同样在本发明的保护范围之内。

在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。

在本发明提供的一实施例中，重组菌株的保藏编号为CGMCC No.13403。

本发明还提供了一种重组菌株的构建方法，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。

作为优选，pyc基因的来源为谷氨酸棒状杆菌。

在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。

作为优选，改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。

本发明还提供了一种生产L-苏氨酸的方法，采用本发明的重组菌株或本发明构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。