[发明专利]一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法

说明书

本发明公开了一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法，包括以下步骤：（1）测活底物同转座酶和反应缓冲液混合（2）进行转座反应（3）加入变性剂（如SDS、盐酸胍等）使转座酶变性，分离转座酶和DNA片段（4）加入够识别底物标记的介质，结合未反应的底物（5）通过选择性手段（如离心、过滤、浓缩等）去除结合了底物的介质（6）检测释放出的带标记的DNA的含量，同标准数值比较，得到Tn5转座酶的活性。该测活方法操作简便、快速，结果重复性好，十分适合于大批量生产中Tn5转座酶的酶活检测。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法。

背景技术

随着测序技术的发展，高通量测序已经广泛的应用于基因组学、转录组学、和医学检测等多个领域，高通量测序技术服务及其相关的测序建库试剂耗材已经成为商业化生物技术产业的一个重要的分支。高通量测序技术包括建库，测序反应和数据处理三个步骤，建库步骤处理待测序的DNA，制备可用于测序的DNA片段；测序反应利用DNA聚合酶的合成反应，结合荧光检测技术，测定DNA片段的序列；数据处理步骤比对和拼接所得的DNA片段序列，最终获得完整的DNA序列。在这三个步骤中，测序反应步骤的自动化程度最高，主要步骤全部由测序仪器完成；数据处理步骤其次，由各类生物信息学软件完成比对和拼接，部分较为困难的数据辅助人工分析和判断；建库步骤是自动化程度最低的步骤，需要大量的人工和试剂。

由于目前的高通量测序技术只能检测短片段的DNA（约150-300bp），测定长片段DNA序列时，需要将长片段的DNA打断成150-300bp的短片段，在片段两端连接特定组合的接头以便于测序数据的分析和拼接。这个过程就是建库。根据打断方法的不同，可以将建库方法分为物理法和酶法，物理法包括雾化和超声打断DNA，酶法包括DNA片段化酶（Fragmentase）、DNA剪切酶（Shearase）和转座酶（Tn5 Transposase）等，除转座酶外，其他的所有建库方法都包含打断DNA，修复DNA片段和DNA片段加接头几个步骤，其中DNA片段加接头一般通过DNA连接酶，需要耗费较多的时间。使用转座酶建库时，上述的三个步骤整合成为一体，仅一步就可以完成打断DNA和DNA片段加接头，可以使建库反应在2个小时内完成。

Tn5转座酶是IS4家族的复合转座子Tn5内部由IS50序列编码的转座酶，包含476个氨基酸残基，分子量53kDa。转座酶能够识别成对的末端序列（End sequence），经过“剪切和粘贴”的方式，完成转座反应。转座酶的转座反应包括以下几个步骤（图1）：

首先，Tn5转座酶识别供体DNA片段中的末端序列，两个Tn5转座酶分子结合，形成活性二聚体；活性二聚体在末端序列的外侧切割双链DNA，将末端序列和其间的DNA从供体DNA上切割下来；之后，活性二聚体同受体DNA结合，二聚体切割受体DNA，形成9bp的粘性末端；活性二聚体随后催化末端序列同受体DNA片段的粘性末端连接，完成转座反应。在体外的反应条件下，完成反应的Tn5转座酶依然同受体DNA片段紧密结合，需要使用变性剂等失活Tn5转座酶才能将其同受体DNA片段分离。目前在体内介导这一分离过程的机理还不太清楚。

目前已知的能够被转座酶识别的末端序列有OE（Outer end，SEQ ID NO 1），IE（Inner end，SEQ ID NO 2）和ME（Mosaic end，SEQ ID NO 3），OE和IE分别是Tn5转座子中IS50序列的外末端序列和内末端序列，转座酶对于OE的选择性高于IE；ME序列是经过突变优化后的序列，转座酶对于ME的选择性高于OE序列。