[发明专利]一种鸭肝微粒体的制备方法

说明书

本发明提供一种鸭肝微粒体的制备方法，包括步骤：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

技术领域

本发明属于蛋白酶学领域，具体涉及一种鸭肝微粒体的制备方法。

背景技术

鸭肝微粒体是鸭肝脏内质网膜的亚细胞组分，富含大量的药物代谢酶：细胞色素P450酶。细胞色素P450酶广泛的参与了类固醇、胆酸、脂肪酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及类维生素等物质的生物合成和代谢；因此，常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的主要工具。有关禽类动物肝微粒体鲜有报道，本发明旨在提供一种简单易操作的鸭肝微粒体制备方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种鸭肝微粒体的制备方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法制备鸭肝微粒体：鸭肝微粒体制备方法的步骤包括：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）HPLC检测鸭肝微粒体亚型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

可选的鸭为体重为1-1.5 kg，21-30日龄龄的雄性鸭；

可选的灌洗肝脏用的清洗液为10 mM PBS（含0.15M KCl和0.2%尼克酰胺，pH 7.4）；

可选的肝湿重比的比例为1:2-1:3；

可选的匀浆缓冲液为含0.15M KCl、1mM EDTA、1mM PMSF的0.05M Tris-HCL（pH7.4）；

可选的加入预冷的匀浆缓冲液的量是沉淀重量的1-2倍；

可选的超声破碎的功率为180-250 W、超声时间为4-5 s，间隔时间为8-10 s，超声次数为15-20次；

可选的超速离心的速度为100000 ×g，首次超速离心的时间为75 min，再次超速离心的时间为45 min；

可选的储存液为含0.25M蔗糖、20%甘油、1mM EDTA和0.15M KCl的0.1M 磷酸缓冲液（pH7.4）。

附图说明

图1：HPLC检测鸭肝微粒体CYP3A4活性的峰图

图2：HPLC检测鸭肝微粒体CYP2E1活性的峰图

图3：鸭肝微粒体CYP3A4和CYP2E1反应速率图

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择体重为1.5 kg的雄性30日龄的麻鸭制备鸭肝微粒体。具体操作如下：

1、禁食，正常饮水24 h后断头处死实验鸭；