[发明专利]编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用

说明书

本发明公开一种编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明进一步公开该基因编码的氨基酸序列，并提供含有该基因的重组载体及重组大肠杆菌以及利用其进行生物转化合成丙谷二肽的方法。本发明所述的基因及其重组工程菌的应用，具有摩尔转化率高，反应速率快，分离容易，且成本低等优势，上述合成方法中，丙谷二肽的最大摩尔转化率可达83.3％。同时，菌体循环回收后可再次应用于丙谷二肽的催化合成，且催化活性稳定。因此，具有极高的市场竞争力和应用价值，为丙谷二肽的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种丙谷二肽的生物合成方法，尤其是直接采用重组大肠杆菌菌体作为全细胞催化剂高效合成丙谷二肽，属于生物技术领域。

背景技术

丙谷二肽(L-Ala-Gln)，又称为N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，具有溶解度高，水溶性和热稳定性强的优点已逐渐替代谷氨酰胺(L-Gln)成为主要的肠外营养用药。

目前，丙谷二肽的合成主要采用化学合成法和生物酶催化法。化学合成法生产丙谷二肽反应步骤多、副产物多、试剂毒性大且非环境友好(唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成与反应研究.厦门大学,2004；中国专利,丙－谷二肽合成方法,CN1392156A)。

而生物酶催化法也存在用酶量大，肽生产率低且仅能催化合成部分较高疏水性氨基酸等弊端。近年来，国外研究人员从枯草芽胞杆菌中获得了一种氨基酸连接酶(Lal)，开发出发酵生产二肽的专利技术，但这种催化合成丙谷二肽的过程需要外源提供ATP，导致二肽的生产成本仍然较高，无法在市场大范围推广使用(Tabata K,HashimotoS.Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolicallyengineered Escherichia coli strain expressing L-amino acidα-ligase.Appliedand environmental microbiology,2007,73(20):6378-6385.)。

CN104480075A和CN105274174A公开了两种生物酶催化合成丙谷二肽的方法，其采用生物酶冻干粉或生物酶缓冲液进行催化反应，但由于酶分离纯化成本高，且反应后难于回收再利用，不适用于实际工业化生产。

发明内容

本发明目的在于提供一套完整的生物转化生产丙谷二肽的技术方案。从寻找优异的编码丙谷二肽合成酶的外源性基因开始，并期望通过基因工程的方法构建重组工程菌，并据其设计合理的生物发酵工程方案，以实现丙谷二肽绿色、高效、低成本的工业化生产。

为实现上述目的，本发明首先提供一种编码丙谷二肽生物合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其二，本发明提供一种丙谷二肽生物合成酶，由上述核苷酸序列为SEQ ID NO.1的基因编码，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其三，本发明提供一种重组载体，该重组载体含有上述核苷酸序列为SEQ ID NO.1的编码丙谷二肽生物合成酶的基因。

再者，本发明提供一种重组大肠杆菌，其特征在于，是将核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的基因转入大肠杆菌获得的。

最后，本发明提供一种丙谷二肽的生物合成方法，其包括使用上述本发明的重组大肠杆菌对底物的转化反应的步骤。

本发明所述的编码丙谷二肽生物合成酶的基因具有优异的促底物转化生成丙谷二肽的能力。本发明进一步，利用该基因构建重组质粒和重组工程菌，并进一步利用重组的大肠杆菌在发酵体系中直接催化合成丙谷二肽，提高了丙谷二肽的转化效率，同时解决了生物转化工程中酶分离纯化难、酶活不稳定、成本高的问题。所述的方法与现有技术相比具有如下技术效果：