[发明专利]一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法

说明书

本发明提供了一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺，pH值为6～10，通过一个热循环过程完成，本发明实现了在一管内一次性完成连接反应，且大大提高了连接反应效率，还具有以下优点：（1）DNA片段的磷酸化和拼接步骤在一管中一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；（2）DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；（3）非DNA序列依赖；（4）被拼接的DNA片段末端不引入其它核苷酸，DNA片段可重用于其他构建工作；（5）价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种一管反应式的DNA 分子克隆拼接方法。

背景技术

DNA拼接技术是当今生物学研究当中最重要的技术方法之一，大部分的分子生物学与细胞生物学都基于这项技术。然而，自从Cohen等研究者在40年前重组了第一个DNA分子，主流的DNA操作方法仍然基于原始的酶切连接方法，传统基于酶切连接克隆方法拥有完善的操作体系，但是在最终拼接产生的DNA 产物当中残留有6bp的核苷酸疤痕；同时，这种传统的方法无法满足当今复杂多样的应用要求。例如代谢工程中的多片段连接，合成生物学当中的DNA片段标准化与DNA片段重用，以及高效可靠地拼接不同大小的DNA片段。

基于上述普遍的需求，众多强大的DNA拼接技术不断产生。大体上来讲，这些技术方法可以被分为两大类，一大类是基于酶切连接，另一大类基于同源重叠。在传统的酶切连接基础上，BioBrick标准的建立使得DNA片段被定义为功能化的片段并且按照特定规则进行拼接。另一个例子是Golden Gate拼接方法，这个方法基于Type IIs限制性内切酶对识别序列之后相隔五个核苷酸的位置进行切割，这样6bp的疤痕最终就不会被包括在产物当中。这个方法也实现了多片段的一次性连接。然而这个基于限制性内切酶的方法仍然不可规避序列依赖性的问题，即只有在序列中存在限制性酶切位点的DNA分子才可以被此方法操作拼接。同时，该方法使用的Type IIs限制性内切酶的种类有限，如果在目标序列当中含有限制性酶切位点，则会大大增加构建工作的复杂程度。

由于上述限制性内切酶的有限性与序列依赖性，人们探索了使用同源重叠的方法进行构建。重叠延伸PCR或者CPEC的方法利用设计PCR末端的同源片段进行搭接，然后通过PCR反应完成扩增。近几年拼接最小人类全合成基因组的 Gibson Assembly是同源重叠的另一个典型例子。Gibson Assembly利用DNA片段末端20～40bp的同源区域，首先通过5’核苷酸外切酶消化产生可互补的同源区域，退火后含有同源区域的片段搭接在一起，通过DNA聚合酶补齐被消化的同源区域，最后通过Taq连接酶补齐接口处的缺刻完成连接。保证Gibson Assembly特异性的根源在于所要拼接前后DNA分子片段末端与头端的20～40 碱基对的核苷酸同源序列。此方法避免了限制性内切酶的使用因此是非序列依赖的，绝大多数的构建工作可通过此方法完成。然而，DNA片段的标准化与重用仍然未能实现，DNA尾端的序列修饰仍然存在。另外，多片段DNA连接仍然不够可靠，多于四片段组装时效率低下，转化子数量非常稀少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：