[发明专利]一种鸡alpha干扰素及其制备方法

说明书

本发明涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。本发明选择pBV220温控表达载体用于构建重组大肠杆菌chIFN‑α‑pBV220株，保藏编码为CGMCC No.13431。用该重组菌株作为生产菌株通过调节培养温度成功诱导并大量表达具有生物活性的chIFN‑α蛋白。该重组菌株表达的具有生物活性的chIFN‑α蛋白不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供一种新产品。

技术领域

本发明涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡的病毒性疾病是危害养鸡业最为严重的疾病之一。目前，我国预防和控制鸡病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸡alpha干扰素(chIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸡的病毒性疾病如新城疫、传染性法氏囊炎、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等具有良好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留等优点，因此chIFN-α产品的研发对鸡病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。

目前chIFN-α产品的研发方法主要包括诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法和基因工程技术表达干扰素蛋白两种方法。诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法生产的干扰素产品面临两个问题：一是大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，二是以病毒作为诱生剂存在潜在病毒污染的情况。此外，这种方法提取的干扰素产量有限、产物成分复杂、价格昂贵，从而限制了其在临床上的应用。以基因工程技术为依托生产的基因重组鸡干扰素产品因产物成分单一、操作简单、产量高和适应于大规模生产等特点而得到了广泛的应用。

基因重组chIFN-α的表达系统根据表达宿主的不同分为原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞表达系统和昆虫表达系统。其中原核表达系统相比于其他的表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉等优点成为重组基因工程chIFN-α大规模工业生产的优选表达系统。而大肠杆菌因具有操作简单和能在廉价的培养基中迅速生长的特征，成为原核表达系统首选的表达菌株。常用于基因重组蛋白表达的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21和JM系列；常用的大肠杆菌表达载体有pBV220、pBV321、pET28a和pET32a等。其中pBV220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为P_L和P_R强启动子，该启动子受λ噬菌体CI基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。pET28a和pET32a表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达目的蛋白。与IPTG诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。

发明内容

本发明的目的是选择pBV220温控表达载体用于构建chIFN-α-pBV220重组菌株作为生产菌株，通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白，用于病毒性疾病的治疗和预防用药。

本发明市基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，本研究选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒)在人羊毛膜细胞(wish细胞)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为235250IU/ml。本发明的产品不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新的药物。

本发明技术方案