[发明专利]一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法

权利要求书

1.一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：包括两个反应物的循环反应，分别是四氢叶酸循环反应和5，10-甲基四氢叶酸循环反应；

所述四氢叶酸循环反应为5-甲基四氢叶酸与L-高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L-甲硫氨酸后，再以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD⁺反应生成5，10-甲基四氢叶酸和NADH；

所述四氢叶酸循环反应中，5-甲基四氢叶酸与L-高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L-甲硫氨酸的反应步骤中，使用的酶为甲硫氨酸合成酶，所述反应的反应式为：5-甲基四氢叶酸+L-高半胱氨酸＝四氢叶酸+L-甲硫氨酸；

所述四氢叶酸循环反应中，以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD⁺反应生成5，10-甲基四氢叶酸和NADH的反应步骤中，使用的酶为氨基甲基转移酶；所述反应的反应式为：甘氨酸+四氢叶酸+NAD⁺＝5，10-甲基四氢叶酸+NH₃+CO₂+NADH+H⁺；

所述5，10-甲基四氢叶酸循环反应为将四氢叶酸循环反应中生成的5，10-甲基四氢叶酸为反应底物，与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸；

所述5，10-甲基四氢叶酸循环反应中，5，10-甲基四氢叶酸与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸的反应步骤中，使用的酶为甘氨酸羟甲基转移酶；所述反应的反应式为：5，10-甲基四氢叶酸+甘氨酸+H₂O＝四氢叶酸+丝氨酸；

通过检测340nm波长处NADH的吸光度上升程度，测算出L-高半胱氨酸的浓度大小进而得出测定结果；

所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其测试步骤为：

S1:配制试剂盒：所述试剂盒试剂包含以下各组分：缓冲液Tris，反应底物5-甲基四氢叶酸钙，反应底物甘氨酸，反应底物NAD⁺，酶激活离子MgCl₂，甲硫氨酸合成酶，氨基甲基转移酶，甘氨酸羟甲基转移酶；

所述步骤S1的试剂盒中各组分的浓度为：缓冲液Tris：20mM-50mM；反应底物5-甲基四氢叶酸钙：5mM-10mM；反应底物甘氨酸：10mM-20mM；NAD⁺：1mM-5mM；酶激活离子MgCl₂：2mM-10mM；甲硫氨酸合成酶：5-15kU/L；氨基甲基转移酶：1-4kU/L；甘氨酸羟甲基转移酶：2-6kU/L；

S2：取步骤S1中的缓冲液Tris，溶解于纯化水中，并用浓盐酸调节pH值；

S3：依次称取步骤S1中的5-甲基四氢叶酸钙、甘氨酸、NAD⁺、MgCl₂，并加入步骤S2的溶液中，搅拌至完全溶解；

S4：取步骤S1中配制好的试剂甲硫氨酸合成酶、氨基甲基转移酶和甘氨酸羟甲基转移酶并各自单独溶解后，加入步骤S3所述的溶液中，搅拌混匀；

S5：测定步骤S4的混匀溶液的pH值，并调节pH值，加入纯化水定容，然后过滤后置于2-8℃备用；

S6:将步骤S5中过滤后的溶液置于水浴平衡后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作为检测物；

S7：按反应液：检测物按比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。

2.如权利要求1所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：所述步骤S2和步骤S5中调节后的pH值为至8.00±0.05；所述步骤S5中加入纯化水定容至500ml，将定容后溶液通过0.22μm膜过滤。

3.如权利要求1所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：所述步骤S6中水浴温度为37℃，平衡时间为15-20min。

4.如权利要求1所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：所述步骤S7中反应液：检测物的比例为50:1。

5.如权利要求1所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：所述试剂Tris、5-甲基四氢叶酸钙、甘氨酸、NAD⁺和MgCl₂，均为Sigma公司生产的试剂。