[发明专利]一种miR-214纳米基因复合物及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-胆固醇聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

合成聚乙烯咪唑：以偶氮二异丁腈为引发剂，半胱胺为链转移引发剂，乙烯基咪唑为单体，通过自由基聚合合成理论分子量为5000的所述聚乙烯咪唑；

合成N-羧基-L-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐：称取摩尔比为1:2.5的L-天冬氨酸-苄脂和三光气溶于无水四氢呋喃以形成反应液，在50摄氏度、氮气保护下搅拌0.5-1h；当反应液澄清透亮时，滴加入无水正己烷，直至所述反应液中出现白色沉淀并迅速消失；将所述反应液置于-20摄氏度冰箱静置过夜，通过重结晶得到N-羧基-L-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐的粗产物； 将粗产物溶于无水乙酸乙酯，过滤，将滤液滴加入无水正己烷中进行重沉淀，重复2次后真空干燥得到所述N-羧基-L-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐；

合成聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂：以所述聚乙烯咪唑为大分子引发剂，以所述N-羧基-L-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐为单体，通过开环聚合反应合成所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂；

合成聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂-胆固醇：将合成好的所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂溶于无水四氢呋喃与无水二甲基亚砜的混合溶剂中，形成第一混合溶液，其中无水四氢呋喃与无水二甲基亚砜的体积比为1:1；将胆固醇甲酰氯溶于无水四氢呋喃中，并加入三乙胺，形成第二混合溶液，且所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂与所述胆固醇甲酰氯的摩尔比为1:5；将所述第二混合溶液缓慢滴加至所述第一混合溶液中，先在冰上反应30min，再在室温下反应24h，得到所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂-胆固醇；

合成所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-胆固醇聚合物：以胱胺为胺解试剂，通过胺解反应使合成的所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂-胆固醇中的苄脂基团被胱胺取代；再通过化学连接将R8多肽连接在胱胺末端的氨基上，形成所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-胆固醇聚合物；

其中，具体的胺解反应包括以下步骤：将胱胺溶于无水二甲基亚砜并加入三乙胺进行脱质子化反应15min，其中胱胺的用量为聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂-胆固醇中苄脂基团摩尔数的50倍；将脱质子化反应后的溶液滴加至聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-苄脂-胆固醇的二甲基亚砜溶液中，在40摄氏度、氮气保护下反应24h；将反应后的液体滴加至冷的盐酸水溶液中，再将其置于至5000Da的透析袋中，分别在0.01M的盐酸水溶液及超纯水中进行透析，之后冷冻干燥得到聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺)-胆固醇。