[发明专利]一种花生四烯酸的微生物发酵方法

权利要求书

1.一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其特征在于固体培养基由以下原料组成：牛肉膏蛋白胨、酵母粉、麦芽糖、维生素A、维生素K、氯化钠、甲氧基肉桂酸辛酯、小麦粉。

2.根据权利要求1所述的一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其特征在于固体培养基由以下原料及其重量份数组成，每100g培养基中含有：牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉5-10g、麦芽糖20-25g、维生素A0.5-1g、维生素K0.25-0.5g、氯化钠1.2g、甲氧基肉桂酸辛酯0.5-0.8g、小麦粉补足。

3.根据权利要求1所述的一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其特征在于发酵培养基由以下原料组成：麦芽糖、牛肉膏蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、氯化钾、十二水合硫酸氢钾、维生素B₁₂、维生素K、碳酸氢钠、水。

4.根据权利要求3所述的一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其特征在于发酵培养基由以下原料及其重量份数组成，每100g培养基中含有：麦芽糖10-15g、牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉10-15g、硝酸钠1-3g、氯化钾1-2g、十二水合硫酸氢钾0.5-1g、维生素B₁₂0.25-0.5g、维生素K0.1-0.2g、碳酸氢钠1-2g、水补足。

5.根据权利要求1所述的一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其特征在于具体步骤，如下所述：

1）产花生四烯酸普通被孢霉发酵固料种子培养

ⅰ）菌种活化：采用斜面菌种活化，试管斜面培养基为PDA固体培养基，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24-26℃培养2-3天。

ⅱ）固料种子培养基的制备：将上述固体培养基配料按比例混合，80-100℃蒸煮20-30min，晾干至散开不结团，按200g/瓶分装进规格为1000mL的K氏瓶中，121℃灭菌30min。

ⅲ）固料种子的培养：将新鲜斜面菌种加15-25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，倒入已灭菌固料培养基，轻摇使其尽量混匀，并于24-26℃培养2-3天，分别于12h和24h各摇匀一次，作为一级发酵的母种。

2）发酵培养

ⅰ）发酵培养基的制备，将上述发酵培养基各组分混合调节pH为5.8-6.0，121℃灭菌30min。

ⅱ）摇瓶发酵培养，即小样发酵培养

以200-300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，按体积百分比为5-10%接种量接入摇瓶发酵培养基，培养温度为26-30℃，摇床转速150-200r/min，培养3-5天；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。

ⅲ）发酵罐发酵培养，即中样发酵培养：以200-300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，按体积百分比为5-10%接种量接入一级发酵罐，发酵温度为26-30℃，培养1.5-2.5天；一级发酵至二级发酵的接种量体积百分比为10-20%，发酵温度前期控制在26-30℃，促进菌体生长，后期为促进花生四烯酸油脂合成，将温度下调至18-20℃，培养周期为3-4.5天；为保证菌体生长和合成油脂的需要，整个发酵过程除自动流加经118℃灭菌25min的重量百分比为40%葡萄糖溶液，以及重量百分比为28%氨水用于控制还原糖在前40h为6-8g/L、40h之后为3-8g/L以及pH为5.8-6.0外，另外进行2次手动补加辅料，补加辅料时间分别为发酵36h和69h，辅料分别由葡萄糖、大豆饼粉、玉米浆粉、橄榄油、磷酸氢二钾及各类微量元素组成，微量元素可以是维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、烟酸胺、泛酸钙、叶酸、生物素、叶绿素中的一种或几种的组合；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。