[发明专利]一种微量蛋白质原位检测的免疫质谱试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于微量蛋白质原位检测的免疫质谱分析的标准品，其特征是采用¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)替代Protein A/Protein G，然后用质谱法对样品中已被特异性抗体捕获的标志物进行精确地鉴别、实时检测。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本的筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析；用抗体-质谱联合可克服这一技术缺点。

目前，在蛋白质功能研究上常用的方法是免疫沉淀。绝大部分免疫沉淀方法是基于Protein A/Protein G和抗体的特异结合。目前Protein A/Protein G的生产基本被几家美国公司所垄断。近十年来，化学生物学的发展为生物医学的研究提供了许多新的工具和技术。我们前期的工作发现了一个环形多肽(Fc-III)和抗体有很强的亲和性，可以被用来纯化抗体。Fc-III的序列是DCAWHLGELVWCT-NH2，它是在小分子环肽库中通过噬菌体展示(phage display)的方法筛选出来的，它能够特异性地与IgG分子Fc片段的铰链区相结合。结构生物学的证据显示，化学合成的Fc-III与IgG的Fc片段结合时呈β发卡的构型，其中的两个Cys残基之间形成了二硫键；Fc-III通过盐桥、氢键、疏水相互作用等多种作用力与Fc片段结合。Fc-III足可以模拟Protein A或G，起到替代的效果。Fc-III能从血清或唾液中分离纯化抗体；利用分子生物学的手段将Fc-III融合表达在蛋白上，可以使用IgG的凝胶颗粒、甚至是原核表达的IgG-Fc的凝胶颗粒进行蛋白纯化的工作。实验表明，这种蛋白纯化的手段具有特异性高、成本低等优势，具有很大的应用前景。本专利拟发展一个以合成¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)为基础的分离纯化抗体的技术，实现免疫共沉淀的灵敏度和重现性；并发展集成化的分析系统使得这个技术能被广泛地用于分子生物学的研究中。

举例，传统用于胰岛素检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术，ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法。举例讲，胰岛素的检测试剂盒制备方法为先将抗胰岛素抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)，然后将含胰岛素的样品(如血清)，加至这个已标有抗胰岛素抗体的容器中；这样，胰岛素就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质；再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗胰岛素抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出胰岛素的总含量。这种方法学的缺点是无法测出标志物，如胰岛素，的单个氨基酸变异(如胰岛素的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，胰岛素被甲基，酰基等修饰，胰岛素的异构体)；即通常被用于传统检测胰岛素试验是检测所谓的总胰岛素量。

因为传统胰岛素检测常常是针对病人胰岛素总体水平，无法直接鉴定变异性标志物，如内源性胰岛素与外源性胰岛素水平，这样就增加了胰岛素个体化活性水平控制的难度。

目前，在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于临床直接鉴定内源性胰岛素与外源性胰岛素检测的、采用¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)替代Protein A/Protein G的标准化免疫质谱试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素为案例的、采用¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)替代Protein A/Protein G的免疫质谱试剂盒及制备方法。

本发明涉及微量蛋白质原位检测的免疫质谱试剂盒及制备方法，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管含¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)的标准品，10～30μl；

一小管含抗胰岛素抗体的、用¹⁴C、²H同位素双标记的环形多肽(Fc-III)标记磁珠，30～50μl；