[发明专利]杂交瘤细胞株及其产生的抗CK18-M30单克隆抗体与应用

说明书

本发明公开了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C201646，以及由此杂交瘤细胞株产生的抗细胞角蛋白18片段M30(CK18‑M30)单克隆抗体。本发明还涉及抗CK18‑M30单克隆抗体在制备CK18‑M30的免疫检测工具中的应用，含抗CK18‑M30单克隆抗体的检测试剂、试剂盒或试纸条，能够实现对样本中CK18‑M30高灵敏度、高特异性快速检测。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，特别涉及制备一种制备分泌抗CK18-M30的单克隆抗体杂交瘤细胞株；由该杂交瘤产生的单克隆抗体及其在CK18相关性肝病检测中的应用。

背景技术

细胞角蛋白18(CK18)是细胞骨架蛋白的一种，除了起到细胞骨架的支撑作用以外，还通过多种途径参与着细胞内的各种反应。CK18作为肝细胞凋亡的指标，在包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的很多肝脏疾病中都有升高，并且与NAFLD患者肝细胞的脂肪变性、小叶炎症、气球样变的程度及纤维化程度相关，同时有中重度纤维化患者的血清CK18水平明显高于轻度或无纤维化患者的水平。

肝病是威胁人类健康的重大问题，脂肪肝、药物性肝损伤、自体免疫性肝病等发病率逐年上升，相当数量的上述肝病患者最终发展为肝纤维化。肝纤维化是所有肝脏慢性疾病的共同通路，早中期可逆转，晚期即肝硬化不可逆转，最终发展为肝功能衰竭危及生命，因此肝纤维化早期诊断意义重大。

当细胞受到损伤性刺激发生凋亡时，多条途径被激活，同时激活了Caspase系统，Caspase在两个位点进行切割，这种形式的裂解是高度凋亡特异的，并且凋亡片段对蛋白酶体的降解作用稳定，能够释放进入血浆中。M30抗原位于CK18裂解片段中，且只在裂解片段能够暴露，因此，M30抗体对于上皮细胞的凋亡是具有特异性的。

细胞角蛋白18片段M30(CK18-M30)作为一个无创性的检测手段，在NAFLD的诊断、NAFL和HASH的鉴别及纤维化程度的判断上有重要临床价值。

因此，研制出一种抗CK18-M30的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种分泌抗CK18-M30的单克隆抗体，应用于CK18-M30的检测。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC)，保藏日期为2016年3月6日，保藏编号为CCTCC NO：C201646。

本发明还提供了一种特异性结合CK18-M30的单克隆抗体HR024-7-6，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)人工抗原的合成：人工合成的含有CK18的第389至第396氨基酸的抗原表位肽SEQ ID NO：1。

(2)将抗原表位肽SEQ ID NO：1分别与KLH和BSA偶联，与KLH偶联的多肽做为免疫抗原，与BSA偶联的多肽做为筛选抗原。

(3)将与KLH偶联的多肽免疫小鼠

(4)单抗的筛选与制备：取小鼠免疫的BALB/c小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，筛选用的包被抗原为与BSA偶联的多肽，最终获得能分泌抗CK18特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为HR024-7-6，亚型鉴定为IgG2a；制备小鼠腹水，通过Protein G亲和层析柱纯化抗CK18-M30单克隆抗体。ELISA测效价为1∶320000。

本发明的另一个目的在于提供一种单克隆抗体HR024-7-6在制备用于检测CK18-M30的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为ELISA试剂、试剂盒或试纸条。