[发明专利]石蒜科植物忽地笑细胞色素P450还原酶2及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及细胞色素P450还原酶及其编码基因与应用。本发明首次揭示了石蒜属植物忽地笑的细胞色素P450还原酶2，其具有良好的辅酶专一性，可以协助细胞色素P450酶发挥催化活性以氧化修饰其底物合成产物。本发明还揭示了编码所述细胞色素P450还原酶的多核苷酸，表达所述细胞色素P450还原酶的载体与宿主细胞，以及生产咖啡酸的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及一种来源于石蒜科植物的细胞色素P450还原酶及其编码基因与应用。

背景技术

植物细胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzymes，CYPs)参与大量植物天然产物的生物合成，是天然产物生物合成的关键酶之一，属于亚铁血红素单加氧酶超大家族，催化多种类型的氧化还原反应，具有结构选择性、区域选择性和立体选择性。CYPs的催化活性严格依赖于细胞色素P450还原酶。细胞色素P450还原酶(EC1.6.2.4 Cytochrome P450Reductase，CPR)是CYPs催化体系的重要组成部分，属于核黄素蛋白家族，具有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域和黄素单核苷酸(FMN)结合结构域。作为CYPs的氧化还原分子伴侣，细胞色素P450还原酶可以从电子供体(还原力)中获得电子，并通过辅因子FAD和FMN，将获得的电子传递给CYPs，协助CYPs所催化的一系列氧化还原反应。如果没有CPR的存在，CYPs对其底物就没有催化活性。因此，CPR是CYPs催化进行结构专一性、区域专一性和立体专一性生物反应所必需的：CPR催化电子从电子供体(还原力)通过FAD和FMN传递到CYPs的亚铁血红素辅基，协助CYPs催化底物的生物转化。

植物细胞中CYPs的种类数量一般有200多种，而CPR蛋白却只有2-5种。也就是说，植物CPR蛋白在协助植物CYPs进行底物的转化(产物的合成)过程中具有较好的适用性。因此，在研究细胞色素P450酶的催化活性以及利用细胞色素P450酶进行生物转化和生物合成时，如果没有对应物种的CPR，可以使用来源于其他物种的CPR代替。也就是说，CPR在植物天然产物的体内合成、生物转化以及发酵过程中具有重要的作用。

忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，富含加兰他敏、石蒜碱、文殊兰碱等石蒜科植物所特有的生物碱(石蒜科生物碱)与其它生物碱、以及其它类型的植物天然产物。这些天然产物具有重要的生物活性和应用价值。例如，加兰他敏作为一种特定的、竞争性的、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在临床上用于治疗阿尔茨海默病(老年痴呆症)。又例如，作为一种苯酚衍生物，咖啡酸是植物苯丙素类天然产物，具有抗氧化、抗病毒、抗癌及抗炎等多种生物医药活性，用于临床及医药、食品和化妆品等行业。作为一个多功能的药效基团和平台化合物，咖啡酸还可以衍生出大量具有医药活性的化合物(包括上述在临床治疗轻、中度老年痴呆症的药物-加兰他敏等)，具有广泛的应用和需求。在这些天然产物的生物合成过程中，细胞色素P450酶(CYPs)参与催化一步或多步反应，而其催化功能依赖于细胞色素P450还原酶(CPR)。但是，石蒜属植物细胞色素P450还原酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的细胞色素P450还原酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式协助细胞色素P450酶进行天然产物的生物转化与生物合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的细胞色素P450还原酶，所述的细胞色素P450还原酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；或

(b)将SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个(如1-90个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或

(c)与SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。