[发明专利]寨卡病毒多片段融合蛋白的制备及IgG/IgM抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明数据生物技术领域，涉及一种利用基因工程多片段融合快速表达技术制备寨卡病毒诊断抗原，及寨卡病毒IgG/IgM抗体快速检测试剂盒(胶体金法)的制备及其使用。

背景技术

2015年，寨卡病毒在全球快速蔓延，已有24个国家和地区出现疫情报道，世界卫生组织于2016年2月1日宣布，将寨卡病毒及小头症列为全球紧急公共卫生事件。

寨卡病毒病(Zika virus disease)属于黄热病毒科的黄病毒属，是由寨卡病毒(Zika virus)，引起的一种自限性急性传染病。寨卡病毒通过受到感染的伊蚊属蚊子叮咬传播到人，还可能由怀孕的母亲在怀孕或生产过程中传播给胎儿或婴儿，也可能发生性传播，或输血传播。感染后，仅有20％的患者出现症状，包括发热、皮症、结膜炎、肌肉和关节痛、全身乏力以及头痛等，这些症状通常持续2～7天。寨卡病毒可能会造成神经和自身免疫系统的并发症，如格林-巴利综合征(Guillian-Barré syndrome)，孕妇感染寨卡病毒可能引起婴儿小头畸形。

目前，全世界已发现超过4000例新生儿小头畸形病例。我国已发现输入病例共8例。寨卡病毒在全球流行态势已异常严峻。因此，需要一种快速、简便、特异的检测试剂盒来应对。而寨卡病毒与同种属的登革热病毒有很高的同源性，且两种病毒均是经蚊虫传播，因此，如何能区别开寨卡病毒和登革热病毒感染就显得尤为重要。

近期，也有些国内外的厂家寨卡病毒诊断抗原问世，但往往由于抗原上游的基因序列对应的抗原表位未做任何修饰，导致不可避免的与登革热病毒的交叉反应。

因此，本发明利用生物信息学分析技术对寨卡病毒和登革热病毒进行表位分析，选取差异表位，然后利用一步法融合表达技术对特异的抗原表位进行融合表达，分别比较其诊断效果，并最终选定灵敏度高、特异性强(与登革热病毒无交叉反应)的融合蛋白作为诊断抗原。

免疫胶体金技术作为一种近年来免疫类新技术发展十分迅速，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用，它具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点。

在此基础上，利用快速简便的胶体金技术进行试剂盒的制备，让寨卡病毒的诊断更加灵敏、特异、便捷，从而更好地为公众健康提供快速检测技术。

本发明即是利用基因工程融合表达技术及胶体金方法学的优势，研制成功一种可区别登革热病毒感染的寨卡病毒的快速诊断试剂盒。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便快速的寨卡病毒检测试剂盒(胶体金法)。该试剂盒采用自主研发优选的融合表达蛋白作为诊断抗原，抗人IgG单克隆抗体A374、抗人IgM单克隆抗体A371和生物素-BSA偶联物分别包被在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，配以胶体金标记的融合表达蛋白和胶体金标记的链霉亲和素及其他试剂，采用免疫层析捕获法原理定性检测人血清中的寨卡病毒特异性的IgM抗体、IgG抗体，从而实现寨卡病毒感染的快速、特异诊断。

本发明在于应用生物信息学技术分析比较寨卡病毒与登革热病毒基因序列，选取寨卡病毒特有的线性表位进行多表位融合表达纯化，并优选出重组蛋白ZIKV-Ag2作为诊断抗原，用胶体金标记来检测样本中寨卡病毒。

本发明的试剂盒包括1)检测试剂卡、2)样品处理液和3)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中，检测试剂卡由1)样品垫、2)胶体金结合垫、3)层析膜、4)吸水材料和5)衬板组成，且上述1)～4)首尾互相衔接并附着在5)上；且所述胶体金结合垫为包被有金标记融合抗原ZIKV-Ag2以及金标记链霉亲和素的玻璃纤维膜；层析膜为包被有抗人IgG单克隆抗体A371、抗人IgM单克隆抗体A372、生物素-BSA的硝酸纤维素膜；衬板为PVC材质；样品处理液由1～50mg/mL的异嗜性抗体阻断剂和0.02％～0.06％NaN₃防腐剂组成。

为了实现本发明，发明人采用了以下技术方案：

(1)生物信息学比对：选取寨卡病毒与登革热病毒基因全长序列进行生物信息学比对分析，分析寨卡病毒特异的线性抗原表位；

(2)特异基因片段的组合：筛选出寨卡病毒特异的线性抗原表位对应的基因片段序列1、2、3；并对片段1、2、3分别进行单独或组合，分别为：

①片段1；

②片段2；

③片段3；

④片段1+片段2融合；

⑤片段1+片段3融合；