[发明专利]一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及叶酸定量检测，液相色谱串联质谱联用检测人血清中叶酸及其代谢物的方法，血清叶酸检测成品试剂盒。

背景技术

叶酸(FA)又名维生素M，维生素B9，属于维生素B族中的重要一种，其化学名为蝶酰谷氨酸，由对氨基苯甲酸，蝶啶，谷氨酸残基结合而成，天然叶酸主要以聚谷氨酸形式存在。人体自身不能直接合成叶酸，主要通过食物摄取，吸收的叶酸主要以四氢叶酸的形式储存在肝脏，也存在于肠壁、骨髓等其他组织中。叶酸通过还原型辅酶II(NADPH)，叶酸还原酶以及维生素C的作用下，还原成具有生理活性的四氢叶酸，随之代谢为其活性成分5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)等，通过血液被带到红细胞或其他细胞中参与DNA的合成。叶酸是人体细胞生长和分裂的必须物质，主要体现在其作为体内最主要的甲基供体，与其他辅酶协同参与DNA的合成和代谢，以及体内氨基酸、蛋白质、神经递质等的再甲基化。叶酸是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，是进行DNA合成不可或缺的，是正常红细胞发育成熟所必需的，如果缺乏会导致骨髓中幼红细胞发育异常，会引发巨红细胞性贫血；也是神经管缺陷的其中一个重要影响因素；还与心血管疾病、痴呆症、认知缺陷等发生有关。

血清叶酸测定可以提供体内叶酸状态的早期指标，结合叶酸及其代谢物的检测可及时反应当前人体叶酸代谢情况。在人血清中，5-甲基四氢叶酸作为叶酸最主要的活性代谢物，其可占叶酸类物质的90％，同时检测血清中叶酸，5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸能较全面的反应当前人体叶酸状态。

叶酸类物质传统的临床检测主要有微生物测定法，同位素放射免疫法，离子捕获法，时间分辨荧光法、化学发光法等传统方法及相关试剂盒，但其问题主要如下：一、这些方法都为间接检测法，因此都不能排除基质效应和忽略了化合物不稳定性，且不同平台间的差异较大，容易造成不同平台结果的不一；二、该类方法没有分别准确检测多个指标，考察叶酸及具有活性的叶酸代谢物成分，从而不能更好去诠释叶酸在人体内的代谢情况，以及与身体健康状况之间的关系。另外，目前还有能够检测叶酸代谢相关基因的技术方法，但是该方法所检测的是相关基因位点，可以用作叶酸代谢能力的病因分析，但是不能用作临床鉴定病人叶酸是否缺乏。

因此，临床检测亟需一种不仅具备高灵敏度，高特异性，高准确度检测结果，还可同时检测叶酸及其代谢物质，并拥有操作简单方便，容易推广的叶酸直接检测方法及试剂盒，以祛除基质效应和化合物不稳定性对实验结果的影响，从而提高临床检测质量。

发明内容：

本发明所要解决的问题是提供一种可以全面检测人体血清叶酸状态的试剂盒，并且能够有效祛除基质干扰，提高检测准确性，操作简便，可同时检测叶酸及其代谢物。

为解决上述问题，本发明公开了一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒及其应用方法，其中：

一、试剂盒组成和配制方法如下：

1、校准品：使用2％～8％BSA稀释液，优选4％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时加入适量的叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，冻干后使用。优选的6个浓度剂量点校准品均按照(0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27.0ng/mL)设置，并且可溯源至WHO International Standard Vitamin B12，Serum Folate and Holo TC。

2、质控品：使用2％～8％BSA稀释液，优选4％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时加入适量叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)原料，配制成包括高、低2个浓度的质控品，冻干后使用。优选的2个浓度的质控品分别按照2.0ng/mL、10.0ng/mL设置。

3、内标准品：使用2％～8％BSA稀释液作为稀释液，优选2％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时将¹³C5叶酸和d3 5-甲基四氢叶酸稀释至终浓度为300ng/mL～600ng/mL，优选400ng/mL。

4、解离剂：1M DTT水溶液。

5、解离剂稀释液：0.1MPBS缓冲液。

6、流动相A：由甲酸与水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。