[发明专利]用于制备肉毒杆菌毒素的培养基组合物

说明书

发明领域

本发明涉及用于生产肉毒杆菌毒素的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养能够生产肉毒杆菌毒素的梭菌属(Clostridium)的菌株的培养基组合物。本发明的培养基组合物包含至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆(garden pea)水解物、棉籽水解物和小麦面筋(wheat gluten)水解物。

发明背景

自19世纪90年代以来，已经发现了分泌神经毒性毒素的多种梭菌属菌种(Clostridium sp.)菌株，并且过去70年已经进行从这些细菌分泌的毒素的表征(Schant,E.J.等,Microbiol.Rev.,56:80,1992)。

自梭菌属菌种衍生的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据其血清学性质，分为七种血清型(血清型A至G)。每种毒素具有大小约150kDa的毒素蛋白质，并且天然含有与其结合的几种无毒性蛋白质的复合物。中等复合物(300kDa)由毒素蛋白质和无毒性非血凝素蛋白组成，而大复合物(450kDa)和非常大的复合物(900kDa)由与血凝素结合的中等大小的复合物组成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知此类无毒性血凝素蛋白功能为保护毒素免受肠中的低pH和各种蛋白酶作用。

毒素在细胞中以具有分子量约150kDa的单一多肽合成，然后通过胞内蛋白酶的作用或用人工酶如胰蛋白酶处理从N端末端开始的1/3的位置处切割成两个单元：轻链(L；分子量：50kDa)和重链(H；分子量：100kDa)。与单个多肽相比，切割的毒素具有大大增加的毒性。两个单元通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合靶细胞的受体(Park.M.K.等,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)，并且功能为在低pH(pH 4)与生物膜相互作用以形成通道(Mantecucco,C.等,TIBS.,18:324,1993)，并且轻链当其可渗透细胞或通过电穿孔等导入时具有干扰神经递质分泌的药理活性(Poulain,B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。

毒素抑制在神经肌肉接头的胆碱能前突触处的乙酰胆碱胞吐以引起虚弱。已认为甚至用非常少量的毒素的处理表现出毒性，这提示了毒素具有任何酶活性(Simpson,L.L.等,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,26:427,1986)。

根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物包括突触泡蛋白(synaptobrevin)、突触融合蛋白(syntaxin)，25kDa突触小体相关蛋白(SNAP25)等，它们是胞吐机构复合物的单元蛋白质。每种类型的毒素使用上述三种蛋白质之一作为其底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点处切割突触泡蛋白，A和E型毒素在特定位点处切割SNAP25，并且C型在特定位点处切割突触融合蛋白(Binz,T.等,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。

特别地，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH 4.0-6.8的稀水溶液中。已知稳定的无毒性蛋白质在约7以上的pH与神经毒素分离，并且因此毒性逐渐丧失。特别地，已知毒性随着pH和温度升高而降低。

肉毒杆菌毒素即使少量也是对人体致命的，并且容易大量生产。因此，它与炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和天花病毒(smallpox virus)一起构成四大生物恐怖武器。然而，发现当A型肉毒杆菌毒素以不系统地影响人体的剂量注射时，它可以使注射部位中的局部肌肉瘫痪。基于这一特点，A型肉毒杆菌毒素可用于宽范围的应用，包括除皱剂(winkle removing agent)、治疗痉挛性偏瘫和大脑性瘫痪的药剂等。因此，对A型肉毒杆菌毒素的需求已经增加，并已经积极开展关于生产肉毒杆菌毒素的方法的研究以满足需求。