[发明专利]基于盐酸处理的革兰氏阳性细菌菌蜕的制备方法

说明书

本发明涉及基于盐酸处理来制备的革兰氏阳性细菌菌蜕及其制备方法，具体地，在根据本发明的方法来制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当以可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落的生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)进行处理的方式来进行培养时，可有效地形成细菌菌蜕，并且所形成的上述细菌菌蜕处于完全保留细胞的外膜形态且在细胞质内未残留蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此，当向体内给药时，对基于增殖的二次感染症等的副作用的危险少，从而根据本发明的方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕可有效地作为用于预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体。

技术领域

本申请主张于2016年04月15日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2016-0046466号的优先权，上述说明书的所有内容为本申请的参考文献。

本发明设计基于盐酸处理来制备的革兰氏阳性细菌菌蜕及其制备方法。

背景技术

细菌菌蜕(bacteria ghost，bacterial ghost)可简单地定义成如下的结构体，即，由于去除了微生物的细胞内的结构物(细胞质包涵体)，从而虽然上述结构体处于内部空的状态，但细胞膜完整地维持外膜(envelope)的形态。细菌菌蜕缺少细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)或遗传物质，从而事实上处于死菌状态，因此并不视为遗传重组生物体(GMO)。

但是，细菌菌蜕原样地维持生菌的外膜形态，因此维持存在于外膜的抗原决定簇(antigenic determinant)，从而可呈现功能上与生疫苗类似的效果。尤其，在治疗细菌感染症的方面，由于使用细菌菌蜕的疫苗(菌蜕疫苗)没有因非特异性的大量细胞质而产生的免疫诱导抑制，从而即使不添加外来的助剂(adjuvant)，也可简单地刺激固有免疫系统和适应性免疫系统。由于这种优点，利用细菌菌蜕的疫苗被视为既低廉，又可有效地克服现有化学药品疫苗等的局限的代替方案。

并且，细菌菌蜕没有作为生菌的增殖性或病原性的功能，因此可使处于非活化(inactivated)状态的细菌菌蜕附着于动物、人类或植物的特殊组织或细胞。而且，由于可导入于植物细胞或动物细胞的内部，因此可使用成可向靶细胞有效地传递重组抗原或核酸的转运系统(delivery system)。

已开发了用于生成这种细菌菌蜕的多种方法。生成细菌菌蜕的最普通的方法为如下的E蛋白质介导溶解法，即，以在革兰氏阴性菌中进行形质转换(transformation)的方式表达克隆有噬菌体(bacteriophage)φX174溶解基因E的质粒(plasmid)。完成形质转换的细菌对E基因进行抑制，并根据温度变化来表达E蛋白质，所合成的E蛋白质并未向细菌表面结构给予物理化学性损伤，并且通过在细菌细胞膜及细胞壁形成跨膜通道来最终释放细胞结构物(非专利文献0001)。这种方法具有如下的优点，即，当克隆质粒时，可将抗原基因转换成所需的多种蛋白质，并且可通过现有的形质转换法和培养法实现大量生产。

但是，为了实现包括上述E蛋白质介导溶解法且通过所克隆的质粒的形质转换的细菌菌蜕的制备方法，而伴随着需要多步骤的分子生物学技术、高价的费用及长时间的制备时间的问题。因此，需要可实现简单的制备技术、低价的生产费用及节约时间的细菌菌蜕的大量生产方法。

最近公开了如下的方法，即，将作为革兰氏阴性菌的大肠菌(E.coli BL21(DE3)pLysS)作为模型，并使用作为化学物质的十二烷基硫酸钠(SDS)、氢氧化钠(NaOH)或过氧化氢(H₂O₂)来制备细菌菌蜕(非专利文献0004)。除此之外，还公开了如下的方法，即，对大肠菌(E.coliDH5α)进行最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration；MIC)的硫酸铵(NH₄)₂SO₄、氯化钙(CaCl₂)或乙二胺四乙酸(EDTA)处理，从而以在细胞壁施加影响的方式进行诱导来制备细菌菌蜕(专利文献0004)。