[发明专利]从多能干细胞分化巨噬细胞

权利要求书

1.一种用于从人多能干细胞或人H1胚胎干细胞培养类原始巨噬细胞的方法，其中所述方法包括：

(a)将所述人多能干细胞或人H1胚胎干细胞与包括5-100ng/ml VEGF、1-20ng/ml BMP4和最高达10μM的GSK3抑制剂的无血清培养基接触并在低氧条件下孵育以诱导所述人多能干细胞或人H1胚胎干细胞分化成中胚层谱系的细胞，其中在步骤(a)之前，将所述人多能干细胞或人H1胚胎干细胞以小于1个小集落/cm²的密度接种；

(b)将所述中胚层谱系的细胞与包括最高达250ng/ml的SCF、最高达50ng/ml的FGF-2、最高达50ng/ml的IL-3、最高达50ng/ml的IL-6、5-100ng/ml的VEGF、和最高达500ng/ml的DKK1的培养基接触并在低氧条件下孵育以使所述中胚层谱系的细胞分化成造血细胞谱系的细胞；

(c)通过将所述造血细胞谱系的细胞与包括最高达250ng/ml的SCF、最高达50ng/ml的FGF-2、最高达50ng/ml的IL-3和最高达50ng/ml的IL-6的培养基接触而在常氧条件下使所述细胞成熟；

(d)将所述造血细胞谱系的成熟细胞与包括最高达100ng/ml的M-CSF的培养基接触并在常氧条件下孵育以促使所述造血细胞分化成类原始巨噬细胞，

其中所述类原始巨噬细胞表达CD163、CD11b、HLA-DR、IBA-1、CX3CR1和CD14。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞是人诱导性多能干细胞(iPSC)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是6-溴靛玉红-3′-肟(BIO)、CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、TWS119、IM-12、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、SB415286、AZD1080、AZD2858、靛玉红、A 1070722、TCS 2002或Tideglusib。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)之前的至少24小时，将所述干细胞以小于1个小集落/cm²的密度接种到涂布有Matrigel的6孔板上。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)之前用包括80％DMEM/F12、20％KnockOut血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇和FGF-2的培养基孵育所述干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述培养基中孵育所述干细胞约1天。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)中将所述干细胞进一步与包括0-50ng/ml的FGF-2的分化培养基接触，并且其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分化培养基是获自Invitrogen的34。

9.根据权利要求7所述的方法，其中在约5％的氧浓度下用所述培养基孵育所述细胞约2天。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在约5％的氧浓度下用所述培养基在步骤(a)孵育所述细胞约2天。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在约5％的氧浓度下在步骤(b)用所述培养基孵育所述细胞约3天。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在常氧条件下用所述培养基在步骤(c)孵育所述细胞约7天。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在常氧条件下用所述培养基在步骤(d)孵育所述细胞至少6天。