[发明专利]用于加快杂交反应的添加剂

说明书

本发明公开了用于加快杂交反应的添加剂，所述添加剂包括：a)葡聚糖硫酸钠的水溶液，b)盐，c)缓冲体系，d)可与至少一种极性非质子溶剂混合的强矿物碱，或至少一种极性非质子溶剂。本发明公开的添加剂使用分子探针对组织学样品和细胞学样品进行研究所需的时间得以缩短；能够将其用于各实验室的传统操作中使用的方案来缩短用分子探针对组织学样品和细胞学样品进行研究的工作时间，而不对操作者的工作造成组织影响，使对患者的快速诊断响应得以实现，同时可以使用本发明公开的添加剂而不用甲酰胺。

技术领域

本发明涉及用于生物技术和诊断领域的分子探针的杂交反应的化合物和方法。具体而言，本发明涉及用作一种或一种以上分子探针(例如DNA、RNA和PNA探针)与组织学和/或细胞学样品中的靶核酸(DNA和/或RNA)的变性反应和杂交反应(几乎同时)中的加速辅助添加剂的水溶液。

本发明涉及在研究和诊断两个领域中，通过原位杂交(ISH)技术对DNA和/或RNA的改变进行分子分析的领域。

本发明还涉及用于待检样品的核酸与分子探针之间的杂交作用的方法。

背景技术

在肿瘤学现有的分子分析技术领域，荧光(FISH)和非荧光(SISH，CISH)原位杂交(ISH)广泛用于界定诊断/预后/预测标志物的结构。

在多种不同方法中，FISH代表了灵敏度和特异性的“金标准”，但是其通常需要平均大约2至3天的工作时间。这对于分析实验室的管理而言是个负担，就患者等待分析结果而言也是一种缺陷。此外，特别是在个性化治疗的病例中，响应时间对于开始适当治疗非常重要。对于原位杂交技术的描述，参见WO2009020932和本发明中所提及的参考文献。同时参考Graziano F,Galluccio N,Lorenzini P,Ruzzo A,Canestrari E,D'Emidio S,CatalanoV,Sisti V,Ligorio C,Andreoni F,Rulli E,Di Oto E,Fiorentini G,Zingaretti C,DeNictolis M,Cappuzzo F,Magnani M,2011年在J.Clin.Oncol,29卷第36期第4789-95页发表的Genetic activation of the MET pathway and prognosis of patients withhigh-risk,radically resected gastric cancer。

随着时间推进，已经出现了可替代标准方法的其它方法和商业试剂盒。然而，在以下方面仍然存在限制：试剂的成本高或与体系相容的分子探针数量有限，并且分子探针发射出的信号类型(当然可观察到)并不总是与实验室现有的显微系统相容。

例如，原位杂交中通常使用的缓冲液由溶剂、加速剂、阻断剂、盐、螯合剂和缓冲液组成。最常用的溶剂为5％至50％之间各种不同浓度的甲酰胺，例如所述加速剂为5％至30％之间各种不同浓度的葡聚糖硫酸钠，例如所述盐为氯化钠、柠檬酸钠和无水柠檬酸三钠。

在常规的缓冲液中还含有诸如鲑鱼精之类的阻断剂和诸如EDTA之类的螯合剂。

可替代标准方法的方法在Matthiesen和Hansen的Fast and non-toxic In-SituHybridization without Blocking of Repetitive SequencesWO2009/144581,WO2010/097655,WO2010/097656,WO2010/097707和WO2013/057310及其包含的参考文献中有描述。

例如，虽然缩短了进行FISH法的时间，但是IQFISH DAKOTM试剂盒中存在的限制在于非常昂贵并且只与一种分子靶标结合(Her-2基因和相关着丝粒测试(使用Texas Red染色的探针))。

待评价的传统方法的第二方面为杂交缓冲液中存在去离子甲酰胺。该化合物对人体有毒，其操作需要特别防护并且对其清理具有严格规定。