[发明专利]聚合酶变体

说明书

本文描述了具有至少一个选自以下的突变的变体pol6聚合酶：H223、N224、Y225、H227、I295、Y342、T343、I357、S360、L361、I363、S365Q、S366、Y367、P368、D417、E475、Y476、F478、K518、H527、T529、M531、N535、G539、P542、N545、Q546、A547、L549、I550、N552、G553、F558、A596、G603、A610、V615、Y622、C623、D624、I628、Y629、R632、N635、M641、A643、I644、T647、I648、T651、I652、K655、W656、D657、V658、H660、F662、L690及其组合。

技术领域

本文尤其提供了含有基于定向进化实验中鉴定的突变的氨基酸改变的经修饰的DNA聚合酶，所述定向进化实验被设计用于选择更好地适合于重组DNA技术中应用的酶。

背景

DNA聚合酶是一种酶家族，其使用单链DNA作为模板以合成互补 DNA链。具体而言，DNA聚合酶可以将游离核苷酸加入新形成链的3’端，导致新链在5’至3’方向的延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性的多功能蛋白。例如，许多DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性。这些聚合酶可以识别不正确掺入的核苷酸，并且酶的3′→5′核酸外切酶活性允许切除不正确的核苷酸(该活性被称为校读)。核苷酸切除后，聚合酶可以重新插入正确的核苷酸，并且复制可以继续。许多DNA聚合酶也具有5′→3′外切核酸酶活性。

已经发现聚合酶用于重组DNA应用，包括纳米孔测序。然而，DNA链以1μs至5μs/碱基的速度快速移动通过纳米孔。这使得记录困难并

且容易出现背景噪声，不能获得单核苷酸分辨率。因此，在DNA链或其片段的测序中可以使用在核苷酸上的可检测标签的应用。因此，不仅需要控制测序DNA的速率，而且还提供具有改善性能(相对于野生型酶)(诸如掺入经修饰的核苷酸，例如具有或不具有标签的多磷酸核苷酸)的聚合酶。

发明简述

本发明提供了基于定向进化实验的经修饰的DNA聚合酶(例如，突变体)，所述定向进化实验被设计用于选择在工业或研究应用中使用的条件下赋予有利表型的突变(例如催化经修饰的多磷酸核苷酸(例如标记的核苷酸，在高盐浓度下)的掺入)。

在一个方面，存在变体聚合酶，其在对应于以下的位置处包含至少一个改变：SEQID NO:2 (Pol6 (具有His标签))的H223、N224、Y225、H227、I295、Y342、T343、I357、S360、L361、I363、S365Q、S366、Y367、P368、D417、E475、Y476、F478、K518、H527、T529、M531、N535、G539、P542、N545、Q546、A547、L549、I550、N552、G553、F558、A596、G603、A610、V615、Y622、C623、D624、I628、Y629、R632、N635、M641、A643、I644、T647、I648、T651、I652、K655、W656、D657、V658、H660、F662和L690。

在一个实施方案中，提供了具有DNA聚合酶活性的经修饰的DNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或总序列同一性的氨基酸序列。