[发明专利]生成动脉内皮细胞群

说明书

描述了在没有胰岛素的情况下在限定条件下生成人动脉内皮细胞的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年2月20日提交的美国临时申请第62/118,553号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在国立卫生院(先进转化科学国家中心)授予的UH2-TR000506的政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

心血管疾病在美国是头号死因，并且大部分血管疾病，如动脉粥样硬化，发生在动脉中。动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病，其由内皮细胞的活化、功能障碍和结构变化引发，导致增加的白细胞-内皮粘附。

从多潜能干细胞生成动脉内皮细胞对于开发针对疾病或病症的疗法而言前景巨大，该疗法将治疗心血管疾病。然而，动脉内皮发育是充满挑战的，因为原代动脉内皮细胞在培养中经过去分化。例如，Prosper等的美国公开专利申请号2009/0104159描述了培养和使用证明有动脉分化“潜力”的血管内皮细胞的方法(第[0136]段)。另外，McCloskey等的美国公开的专利申请号2012/0064040描述了化学限定的培养条件以从胚胎干细胞衍生内皮细胞。然而，同样，该公开似乎仅仅证明了从胚胎干细胞分化动脉内皮细胞的潜力，并且获得非常低的结果。

从人胚胎干细胞衍生动脉内皮细胞的现有方案在很大程度上已经失败。因此，本领域仍然需要用于从人多潜能干细胞生成人动脉内皮细胞的高效、限定和可放大规模的方法。

发明内容

在第一方面，本文提供了获得动脉内皮细胞的方法。该方法可包括或基本由以下组成：在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞，该培养基基本没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群。该群的动脉内皮细胞可表达选自下组的一种或多种标志物：肝配蛋白2、神经毡蛋白1(NRP-1)、Δ-样4(DLL4)、肝配蛋白-B2(EFNB2)、CD44、CXCR4/CD184、间隙连接蛋白α-4(GJA4)、Hey1、Jagged-1(JAG1)、Notch1、和Notch4。该细胞群可包含至少80％动脉内皮细胞。

无血清、无白蛋白、化学限定的培养基可包含FGF、VEGF、Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酯抑制剂。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。

在一些情况中，通过在包含骨形态发生蛋白(BMP)、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂的无血清、无白蛋白、化学限定的细胞培养基中培养人多潜能干细胞持续约2天的时间以获得包含中胚层细胞的细胞群来获得中胚层细胞。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。多潜能干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞。Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂可以是Gsk3抑制剂。Gsk3抑制剂可选自下组：CHIR 99021、CHIR 98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB 216763、SB 415286、AR A014418、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。Notch激动剂可选自下组：白藜芦醇(3,4',5-三羟基茋)、丙戊酸、和辛二酰二羟肟酸。TGF-β抑制剂可以是SB431542。肌醇单磷酸酯的抑制剂可以是L-690,330。

在另一个方面，本文提供了按照本文提供的方法获得的基本纯的，动脉内皮细胞的分离群。分离群可包含至少90％动脉内皮细胞或至少99％动脉内皮细胞。