[发明专利]一种抗体药物偶联物的制备方法

说明书

一种抗体药物偶联物的制备方法。具体而言，涉及抗体药物偶联物的合成和纯化步骤，所述的纯化步骤包括分子排阻步骤。

技术领域

本发明涉及一类抗体药物偶联物的制备方法，尤其涉及一类抗体药物偶联物的制备方法的纯化步骤。更具体地说，本发明涉及抗体药物偶联物T-DM1及P-mab-linker-MC-MMAF的制备方法。

背景技术

化疗依然是包括手术、放疗、以及靶向治疗法在内的最重要的抗癌手段之一。尽管高效细胞毒性药物的种类很多，但是肿瘤细胞和正常细胞之间差别很小，限制了这些抗肿瘤化合物由于毒副作用在临床上的广泛应用。而抗肿瘤单克隆抗体对于肿瘤细胞表面抗原的特异性，抗体药物已成为抗肿瘤治疗的前线药物，但单独使用抗体作为抗肿瘤药物时，疗效经常不尽人意。

抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒性药物相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒性药物的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响(Mullard A，(2013)Nature ReviewsDrug Discovery，12：329-332；DiJoseph JF，Armellino DC，(2004)Blood，103：1807-1814)。

抗体药物偶联物的制备方法主要包括偶联物的制备和纯化两个步骤。纯化步骤可以去除抗体药物偶联物初始制备液中的小分子及多聚体等杂质，提高纯度。

通常纯化步骤会用到离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)方法或者切向流超滤(TFF，超滤)。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别，而进行分离的一种层析方法。采用离子交换层析时，由于抗体药物偶联物样品中抗体分子偶联药物的数量不同，从而影响不同载药量的抗体药物偶联物的电荷分布。因此在采用离子柱进行层析分离时，药物载量引起的电荷分布会比较大的影响层析结果，比如影响最终层析产物的纯度及平均载药量。

切向流超滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，切向流过滤时，待过滤的液体的流动方向和过滤膜平面的方向平行，液体就会垂直于膜表面穿过膜孔。切向流超滤方法可以很方便除去体系中的小分子杂质，但缺点是无法除去分子量比较大的一些杂质。

分子排阻色谱法又称空间排阻色谱法(SEC)或凝胶色谱法，是利用多孔凝胶固定相的独特性，凝胶孔隙的孔径大小，高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系，而对溶质进行分离的方法。其分离机理主要取决于凝胶的孔径大小与被分离组分分子尺寸之间的关系，与流动相的性质没有直接的关系；样品分子与固定相之间不存在相互作用。色谱固定相是多孔性凝胶，仅允许直径小于孔径的组分进入，这些孔对于溶剂分子来说是相当大的，以致溶剂分子可以自由的扩散出入。样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先从柱中被流动相洗脱出来；中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，在柱中受到滞留，较慢地从色谱柱洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢的被洗脱出；溶解样品的溶剂分子，其分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出，从而实现具有不同分子大小样品的完全分离。分子排阻法可以通过不同分子量的组分在在凝胶中的保留时间差异不同，从而区分出不同分子量的组分。而且该方法对组分的不同电荷分布没有要求。因此分子排阻色谱法在进行纯化时，不受分子的电荷分布情况的影响。

T-DM1是一种抗体-药物偶联物(ADC)，由赫赛汀(曲妥珠单抗)和小分子微管类药物DM1偶联而成。我们发现在用常规方法制备T-DM1时，无法得到同时符合载药量和SEC纯度要求以及回收率的产物。