[发明专利]重叠扩增子的选择性扩增

权利要求书

1.一种选择性扩增具有重叠区域的靶核酸片段的方法，包括步骤：

(a)获得第一核酸序列，所述第一核酸序列包括第一标签(t2)和第一正向引物(F1)，所述第一正向引物与第一靶核酸片段互补，

(b)获得第二核酸序列，所述第二核酸序列包括第二标签(t1)和第一反向引物(R1)，所述第一反向引物与所述第一靶核酸片段互补，

(c)获得第三核酸序列，所述第三核酸序列包括所述第二标签(t1)和第二正向引物(F2)，所述第二正向引物与第二靶核酸片段互补，

(d)获得第四核酸序列，所述第四核酸序列包括第三标签(t3)和第二反向引物(R2)，所述第二反向引物与所述第二靶核酸片段互补，其中所述第一靶核酸片段和所述第二靶核酸片段具有重叠核酸区域，F2与所述重叠核酸区域的一条链的5’端互补，R1与所述重叠核酸的另一条链的5’端互补，

(e)混合所述第一靶核酸片段、所述第二靶核酸片段、所述第一核酸序列、所述第二核酸序列、所述第三核酸序列、所述第四核酸序列以及有效量的用于执行聚合酶链式反应(PCR)所必需的试剂；

(f)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(e)的混合物循环至少两次，以及

(g)在比步骤(f)中的退火温度高的退火温度下，通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f)的混合物循环以获得扩增产物，其中，步骤(g)中的退火温度高以防止最短的扩增子被主要扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸序列进一步包括在所述第二标签(t1)和所述第一反向引物(R1)之间的第二正向引物(F2)的全长序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸序列进一步包括在所述第二标签(t1)和所述第一反向引物(R1)之间的第二正向引物(F2)的5’端部分序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第二正向引物的5’端部分序列包括F2序列的10-90％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(f)中的所述PCR循环重复2-10次。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第三标签和所述第二标签相同。

7.根据权利要求5所述的方法，进一步包括步骤：

(h)将来自步骤(g)的扩增产物，与第一和第二通用PCR引物以及有效量的用于执行PCR所必需的试剂混合，其中所述来自步骤(g)的扩增产物是处理的或未处理的，所述第一和第二通用PCR引物分别与t1和t2结合但是不与所述第一靶核酸片段和所述第二靶核酸片段结合，以及

(i)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对步骤(h)的混合物循环以获得第二扩增产物，其中，所述第一标签和所述第三标签相同。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述来自步骤(g)的产物是通过稀释、单链核酸外切酶消化、纯化或适配体连接而预处理的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高2-35℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高4-35℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高5-25℃。

12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高6-20℃。

13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高6-15℃。