[发明专利]将多种表达构建体引入真核细胞的方法

权利要求书

1.一种将多种表达构建体引入真核细胞的两个或更多个靶基因座的方法，所述方法包括：

(a)用一个或多个第一构建体和一个或多个第二构建体转化真核细胞群体，

其中该真核细胞包含(1)一个或多个第一靶基因座，每个第一靶基因座包含一对第一重组识别位点和第二重组识别位点，和(2)一个或多个第二靶基因座，每个第二靶基因座包含缺少选择性功能的第一选择性标记的第一片段；

其中所述一个或多个第一构建体各自包含一个或多个第一表达盒，每个第一表达盒包含编码感兴趣的第一蛋白的第一多核苷酸，其中在每个第一构建体中所述一个或多个第一表达盒在一侧由第一重组识别位点侧翼，并且在另一侧由与该第一靶基因座的相同重组识别位点对应的第二重组识别位点侧翼；并且

其中所述一个或多个第二构建体各自包含一个或多个第二表达盒，每个第二表达盒包含编码感兴趣的第二蛋白的第二多核苷酸，并且其中在每个第二构建体中所述一个或多个第二表达盒在一侧由对应的第二靶基因座的同源区侧翼，并且在另一侧由该缺少选择性功能的第一选择性标记的第二片段侧翼，其中该第二片段包含与该第二靶基因座的第一选择性标记的第一片段的相应序列同源重叠的序列；并且

(b)使用每个第一选择性标记来选择转化体，其中每个第一选择性标记的第一片段和第二片段进行重组以变得有功能，并且第二构建体的同源区与第二靶基因座的同一相应区域进行同源重组，其中将每个第二表达盒整合在相应的第二靶基因座处，并且其中第一构建体的第一和第二重组识别位点在第一靶基因座的相应第一和第二重组识别位点处进行重组，该重组由至少一种重组酶驱动，该重组酶将每个第一表达盒整合在相应的第一靶基因座处。

2.如权利要求1所述的方法，其中用该一个或多个第一构建体和该一个或多个第二构建体转化该真核细胞群体是以任何顺序依次进行的。

3.如权利要求1所述的方法，其中用该一个或多个第一构建体和该一个或多个第二构建体转化该真核细胞群体是以共转化进行的。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在每个第一靶基因座处的第一和第二重组识别位点是相同的重组识别位点。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在每个第一靶基因座处的第一和第二重组识别位点是不同的重组识别位点。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在每个第一靶基因座处的第一和第二重组识别位点是相同和不同重组识别位点的组合。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中这些重组识别位点选自下组，该组由以下各项组成：来自拜耳接合酵母的B2系统、来自双孢接合酵母的B3系统、来自25枯草芽孢杆菌质粒的β-重组酶-六系统、来自噬菌体Bxb1的Bxb1、噬菌体P1的Cre-lox系统、来自噬菌体D6的Dre、酿酒酵母的FLP-FRT、来自细菌转座子Tn1000的δ-γ-es系统、来自噬菌体μ的Gin-gix系统、来自噬菌体HK022的HK022、来自果蝇克鲁维酵母的KD系统、Mx9噬菌体转化系统、链霉菌属噬菌体鲁氏接合酵母的R-RS系统、来自大肠杆菌的Tn3、来自溶珊瑚弧菌的Vika重组酶和温和乳球菌噬菌体TP901-1的Xis-att系统及其组合。

8.如权利要求7所述的方法，其中，FLP-FRT系统的翻转酶识别位点选自下组，该组由以下各项组成：F、F3、F10、F13、F14、F15、Fa和F3a及其组合。

9.如权利要求7所述的方法，其中Xis-att系统的TP901-1位点选自下组，该组由以下各项组成：attB和attP及其组合。

10.如权利要求7所述的方法，其中Cre-lox系统的Lox位点选自下组，该组由以下各项组成：LoxP、Lox71、Lox66、511、Lox 5171、Lox 2272、M2、M3、M7和M11。