[发明专利]外泌体的破坏方法、外泌体的破坏试剂盒及来自正常细胞的外泌体的分离方法

说明书

本发明涉及的外泌体的破坏方法具有下述步骤：准备抗菌肽的步骤；和通过使所述抗菌肽与外泌体共存从而破坏所述外泌体的步骤。

技术领域

本发明涉及外泌体(exosome)的破坏方法、外泌体的破坏试剂盒及来自正常细胞的外泌体的分离方法。

背景技术

外泌体的概要

外泌体是一种由细胞分泌的细胞外颗粒。具体而言，外泌体是从具有由脂质双层膜形成的泡囊结构的细胞中释放出的直径为30nm～100nm左右的小泡。该外泌体通过被摄入至与分泌该外泌体的细胞(以下也称为分泌细胞)不同的其他细胞内而在分泌细胞与上述其他细胞之间进行信息传递是已知的(非专利文献1和2)。

外泌体的稳定性

外泌体的膜结构通常比细胞的膜结构更稳定是已知的。例如，非专利文献3中记载的实验结果表明，即使在-20℃的温度条件下、不添加糖类等稳定剂地对外泌体进行了4次冻融处理的情况下，该外泌体中的内包物仍然被稳定地维持。另一方面，已知对于被称为动物细胞的细胞而言，通常，只要不使用上述的稳定剂，则无法耐受冻融处理。由此可以推测，外泌体具有比动物细胞更稳定的膜结构。

另外，外泌体与细胞的膜结构的形成步骤不同。并且，将外泌体的膜结构与细胞的膜结构进行比较的情况下，二者的膜表面积、存在于膜表面的表面蛋白质的种类不同。基于上述情况也可以认为外泌体的膜结构是比细胞的膜结构更稳定的结构。此外，由于外泌体并非活细胞，因此，不属于由凋亡导致的细胞程序性死亡(其可适用于一般细胞)的对象。

外泌体与疾病的关系

近年来，对外泌体与各种疾病之间存在相关关系的情况已进行了各种报道。尤其是着眼于癌细胞所释放的外泌体，就上述外泌体对癌症这一特定疾病造成的影响已报道了各种研究结果。例如，报道了下述可能性：在癌细胞所释放的外泌体中含有的血管新生诱导因子被健康正常的血管内皮细胞摄入的情况下，由上述血管新生诱导因子诱导癌组织周边的血管新生，从而使得癌转移、浸润进展(非专利文献4～6)。

另外，近年来，关于外泌体与各种疾病的相关性，还不断发现外泌体内含有与疾病有关的信息。例如，非专利文献3中，报道了存在于癌患者血液内的外泌体中内包有成为癌症生物标志物的物质(PSA、HER2、EGFR等蛋白质；miR-21、miR-200a等微RNA；Apbblip、ASPN等信使RNA；KRAS等DNA；以及各种代谢产物等)。

特别地，作为成为癌症生物标志物的物质而被外泌体内包的微RNA被认为有望用作癌的检查指标。生物的微RNA已被记录于miRBase(URL：http：//www.mirbase.org/)数据库中。其中，截至2015年，人的微RNA已知有2588种。另外，已知上述的人的微RNA的表达模式根据脏器种类的不同而不同，在正常细胞与癌细胞之间也是不同的。鉴于上述情况，近年来，为了开发利用血液检查(其对被血液中的外泌体内包的微RNA进行分析)来诊断癌的部位、进展程度的技术而进行了锐意研究(非专利文献7)。

外泌体的分离回收(捕集)·除去方法

作为着眼于外泌体的分离回收(捕集)·除去方法的技术，例如有以下技术。

作为用于从人的体液(血液、唾液、尿等)、细胞培养液中回收外泌体的方法，截至2015年，非专利文献8等中记载的超速离心法是最常用的方法。例如，从细胞培养上清液、体液中回收外泌体的情况下，利用过滤器等除去细胞碎片等大的夹杂物后，在4℃、100,000G的条件下实施70分钟超速离心，由此可回收所期望的外泌体。另外，非专利文献8中也记载了通过利用PEG等共沉淀剂使外泌体在细胞培养上清液、体液中沉淀从而进行回收的方法(非专利文献8)。

另外，专利文献1中公开了利用与外泌体特异性结合的抗体来吸附除去该外泌体的技术。具体而言，专利文献1中记载了利用与存在于外泌体的小泡表面的CD9、CD63及CD81等4次跨膜蛋白特异性结合的抗体来吸附除去该外泌体的方法。