[发明专利]通过B细胞淘选和增殖高通量产生单克隆抗体

说明书

交叉引用

本申请要求2015年5月18日提交的美国临时申请第62/135,084号的权益，所述申请以引用的方式并入本文中。

背景技术

哺乳动物响应于通过抗原免疫接种而产生非常多样的抗体库的能力已经用于广泛领域中，包括诊断和治疗。数十年前Kohler和Milstein研发杂交瘤技术并且现今已经研发数种用于产生单克隆抗体的低通量方法。这类方法包括B细胞永生化、通过单细胞PCR克隆编码抗体的基因和cDNA和需要生成巨大重组抗体库的活体外“组合”方法。

高通量地开发抗体的方法一直发展缓慢，因为单独基于序列信息，不可能确定结合抗体的抗原和哪些重链和轻链应配对在一起。

Lightwood(免疫方法杂志《(J.Immun.Methods)》2006 316:13-143)描述用于产生高亲和力单克隆抗体的方法。在Lightwood的方法中，将来自经免疫的兔的相对少量的B细胞放入多孔ELISA板的每个孔中，所述ELISA板含有固相抗原的涂层。在充分洗涤以除去未结合的细胞以及以低亲和力结合的B细胞之后，将保留的B细胞培养7天以诱导增殖和免疫球蛋白的分泌。筛选上清液以鉴定所述板的哪些孔含有抗原特异性抗体。通过RT-PCR从各个孔中回收单个重链和轻链可变区基因，并测序。Lightwood方法，由于其需要将相对少滴定量的B细胞沉积到96孔板的凹孔中、筛选上清液和对从各个孔收获的细胞执行PCR，所以固有地低通量。此外，Lightwood的方法每孔需要单个活化B细胞或相对少量的活化B细胞，因为不这样的话重链和轻链配对将是未知的。此外，使用Lightwood方法产生的活化B细胞的数目对于工业规模生产杂交瘤是不足够的。

Reddy(《自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)》2010 28:965-9)描述基于生物信息学的方法以从经免疫的小鼠的骨髓浆细胞(BMPC)得到(mine)抗体可变区-基因抗体库。Reddy发现，骨髓浆细胞的抗体库在免疫接种之后变得高度极化，其中最丰富的序列占总抗体库的约1％到超过10％之间的频率。Reddy基于最丰富的可变重(VH)基因和可变轻(VL)基因的相对频率将它们配对，使用自动基因合成将它们重构，并且在细菌或哺乳动物细胞中表达重组抗体。以此方式从六个小鼠(每个用三种抗原中的一种免疫)产生的抗体大部分是抗原特异性的(21/27或78％)。骨髓浆细胞并不容易获得，因为它们的分离需要动物安乐死和选择CD138⁺细胞。因此，虽然Reddy的方法的一些方面可被认为是高通量的，但他的方法仍然相当受限，因为其需要从安乐死动物的骨髓中分离的特定类型的浆细胞(BMPC)。

Kodituwakku等人(《免疫细胞生物学》2003 81:163-170)综述了在分离抗原特异性B细胞的方法中的现有技术水平，例如通过淘选和其它类似技术。Kodituwakku作出结论，虽然存在若干种用于分离抗原特异性B细胞的方法，但那些方法提供非常多变的结果并且受非特异性结合的困扰，所述非特异性结合继而降低在分离的群体中所需细胞的纯度和富集。

考虑到上文，仍需要高通量产生抗体的方法。

发明内容

本文尤其提供一种用于产生富集的抗原特异性浆细胞群体的方法。在一些实施方案中，方法可包含：(a)从已经通过抗原免疫的动物获得细胞样品，其中所述样品包含B细胞；(b)通过以下富集抗原特异性B细胞群体，所述B细胞包含对抗原具有特异性的细胞表面抗体：i.使在所述样品中的至少10⁵个细胞全体与抗原或其部分接触；和ii.分离与抗原或其部分结合的细胞；和(c)在抗原或其部分存在下，全体活化富集的B细胞，以产生富集的抗原特异性浆细胞群体。

根据方法如何实施，方法可具有优于常规方法的某些优势。举例来说，如上所述，大多数分离抗原特异性B细胞的方法得到含有大量与底物非特异性结合的污染细胞的细胞群体。本文所述的方法的活化步骤，仅活化具有与抗原结合的表面系留抗体的B细胞。此方法提供两种作用，首先活化步骤仅使与抗原特异性结合的那些B细胞增殖，从而增加那些细胞相对于与支持物非特异性结合的细胞的相对浓度。其次，方法的活化步骤使重链和轻链mRNA的表达仅在与抗原特异性结合的那些B细胞中诱导。换句话说，额外活化步骤允许选择性地刺激记忆B细胞以分化和变为成浆细胞和浆细胞，其快速分裂并表达较大量的抗体。