[发明专利]原代造血细胞中的蛋白递送

权利要求书

1.一种编辑细胞的基因组的方法，其中所述细胞是原代T细胞，所述方法包括：

a)提供包含Cas9核糖核蛋白复合物和所述细胞的反应混合物，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含Cas9核酸酶结构域和导向RNA，其中所述导向RNA与所述细胞基因组的靶标区域特异性杂交；并且

b)通过电穿孔将所述Cas9核糖核蛋白复合物引入到所述细胞内。

2.权利要求1的方法，其中所述方法提供至少20％的基因组编辑效率。

3.权利要求1的方法，其中所述细胞不包含编码所述Cas9的核酸和/或编码导向RNA的DNA核酸。

4.权利要求1的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞未被永生化或转化。

5.权利要求4的方法，其中在b)的引入之后，所述细胞未被永生化或转化。

6.权利要求1的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞没有经过传代。

7.权利要求6的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞直接分离自宿主生物体或组织并被培养。

8.权利要求6的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞直接分离自宿主生物体或组织并且没有经过培养。

9.权利要求1的方法，其中所述电穿孔包括将所述反应混合物放置在阴极和阳极之间的室中，并且在所述阴极和所述阳极之间施加20kV/m至100kV/m的电压电位。

10.权利要求9的方法，其中所述电压电位作为长度为5ms至100ms的脉冲被施加。

11.权利要求10的方法，其中所述方法还包括重复施加电压电位脉冲2-10次。

12.权利要求9的方法，其中：

所述室是具有纵向长度和水平横截面积的中空室；

所述室包括由所述纵向长度隔开的第一和第二远端末端；并且

所述室具有：

在第一远端末端的第一电极；和

与所述室的第二远端末端流体连通的包含电解液的储蓄池，所述储蓄池具有第二电极。

13.权利要求12的方法，其中所述室的纵向长度与水平横截面积之比为50至10,000。

14.权利要求1的方法，其中所述反应混合物中的所述Cas9核糖核蛋白复合物的浓度为0.25μM至5μM。

15.权利要求1的方法，其中所述反应混合物中的所述Cas9核糖核蛋白复合物的浓度为0.9μM至1.8μM。

16.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含1x10⁵至4x10⁵个原代T细胞。

17.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含2x10⁵至2.5x10⁵个原代T细胞。

18.权利要求1的方法，其中所述原代T细胞是调节T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。

19.权利要求1的方法，其中所述原代T细胞是CD4⁺T细胞。

20.权利要求1的方法，其中所述原代T细胞是CD4⁺CD25^hiCD127^lo调节T细胞。